撰文 | 李欣茜 张婷 仲银召 郑宇含 张彦康 李雨
编辑 | 孟美瑶
校对 | 张婷
研究背景
肝脏具有高度的代谢灵活性，能在各种复杂条件下迅速做出反应，调整代谢活性以满足机体需要。例如，在进食期间，肝脏会激活脂肪酸从头合成（DNL）、糖原合成和蛋白质合成等合成代谢途径，而在禁食期间肝脏则会转变为几乎相反的代谢状态，激活脂肪酸氧化、糖异生（GNG）和蛋白质分解等。通常认为，是激素发挥作用阻止这些代谢相反途径的同时激活。例如，进食后的胰岛素信号会促进DNL相关酶的转录和翻译后激活，同时抑制GNG。相反，在禁食时，低胰岛素和高胰高血糖素信号会抑制DNL并激活GNG。然而，代谢物也可以通过变构效应、浓度效应、调节氧化还原状态及信号转导等多种方式调控代谢。因此，代谢物介导的这些机制很有可能参与肝脏代谢调控。
乙酰辅酶A（CoA）和丙二酰辅酶A是调控肝脏代谢的经典代谢物。乙酰辅酶A是β-氧化的产物，也是DNL的前体。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）能催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A。ACC具有不同亚型，其中，ACC1位于细胞质中，催化产生的丙二酰辅酶A主要用于合成长链脂肪酸（LCFAs）（DNL），或延长必需脂肪酸的脂肪酸链（FAs，如亚油酸和亚麻酸）从而产生长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）；而ACC2则位于线粒体膜上，催化产生的丙二酰辅酶A可以抑制肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1，促进LCFAs转运进线粒体），从而抑制β-氧化（小编注：ACC1和ACC2是ACC的两种亚型，在氨基酸序列上具有75%的相似性，主要区别是ACC2包括了一个特有的N端结构域，帮助其定位到线粒体。尽管ACC1和ACC2都能够催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，但亚细胞定位的不同决定了其下游功能的不同。相比于ACC1主要在细胞质中生成丙二酰辅酶A，ACC2主要在线粒体外膜催化产生丙二酰辅酶A，而CPT-1同样位于线粒体外膜且丙二酰辅酶A会变构抑制CPT-1的LCFAs转运功能，因此ACC2产生的丙二酰辅酶A会通过调控CPT1活性参与抑制脂肪酸β氧化。进一步的，ACC1和ACC2的不同功能也与它们在不同组织中的表达差异有关。ACC1在脂肪生成相关组织如肝脏和脂肪组织中表达量较高，而ACC2则主要在脂肪酸氧化相关组织如心肌和骨骼肌中表达。此外，线粒体β氧化并不仅仅只受ACC2调控，一方面，β氧化调控本身是一个复杂的过程，β氧化相关酶本身表达及活性都受到多种因素调控，如PPARα在转录层面上调控CPT1、MCAD等多种β氧化相关酶的表达。另一方面，ACC2本身也不是直接参与β氧化的酶，而是通过其代谢产物丙二酰辅酶A进一步调控β氧化）。禁食期间，由于胰岛素水平降低、胰高血糖素升高和AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）活性增加，ACC1/2活性被抑制，导致DNL减少，脂肪酸氧化被激活。值得注意的是丙二酰辅酶A水平降低后激活β-氧化引发的进一步代谢改变也与其他禁食相关特征相关联。β-氧化产生的线粒体乙酰辅酶A变构激活丙酮酸羧化酶（PC），催化丙酮酸转化为草酰乙酸（OAA）。OAA和其他三羧酸循环（TCA循环）中间产物可为GNG提供原料（小编注：OAA需要穿梭到胞质再进行。OAA需要经磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化形成磷酸烯醇丙酮酸（PEP），才能参与GNG。由于PEPCK有不同的定位，OAA穿梭到胞质的方式也有所不同。当PEPCK位于线粒体基质中时，PEPCK可以直接催化OAA生成PEP，PEP再经线粒体内膜上的转运蛋白运到胞质中，参与GNG。当PEPCK位于细胞质基质时，不能直接催化线粒体中的OAA形成PEP，就需要线粒体基质中的苹果酸脱氢酶（MDH）或天冬氨酸氨基转移酶（GOT）催化OAA形成苹果酸或天冬氨酸，再经线粒体内膜上的转运体将苹果酸或天冬氨酸运到胞质中，在胞质中MDH或GOT作用下重新生成OAA，最后再由胞质中的PEPCK将OAA转变成PEP。PEP沿着糖酵解6步连续的逆反应形成1,6-二磷酸果糖，在1,6-二磷酸果糖磷酸酶的催化下水解为6-磷酸果糖，再经6-磷酸葡糖磷酸酶水解产生葡萄糖，完成GNG），维持机体内能量与氧化还原稳态，并可能进一步与各种转录因子相互作用（小编注：TCA循环的中间产物能与转录因子相互作用，调控基因表达。例如，乙酰辅酶A可以调节一些转录因子（如Smad2）的乙酰化，进而参与调控基因表达。延胡索酸和琥珀酸有助于提高抗氧化转录因子（如 Nrf1/2、Hif-1和If1）的稳定性，促进细胞抗氧化能力）。因此，丙二酰辅酶A可能会通过以上这些机制参与多种代谢途径的调控。
ACC1/2缺失会抑制丙二酰辅酶A和DNL，激活脂肪酸氧化，减少肝脏甘油三酯（TG）水平，ACC抑制剂也复现出了这些结果，并已应用于治疗代谢紊乱相关脂肪肝病（MASLD）的临床试验。然而，抑制ACC1/2也可能带来负作用，例如通过抑制PPARα信号及激活SPEBP-1促进TG分泌，引发高血脂（小编注：关于缺失ACC的影响的研究仍存在矛盾的地方，例如，有研究表明用ACC1/2抑制剂MK-4074治疗脂肪肝患者，能显著降低患者肝脏TG水平，但会显著促进血浆TG水平。进一步的研究表明，缺失ACC1/2会抑制丙二酰辅酶A合成，降低肝脏中的多不饱和脂肪酸 (PUFA) 浓度，而PUFA浓度降低能显著激活SREBP-1，SREBP-1是肝脏脂肪酸和TG生成的关键转录因子，促进GPAT1表达。GPAT1利用来自脂肪组织的脂肪酸合成TG，并形成VLDL，分泌至血浆中，引发高血脂。此外，据报道，缺失ACC会抑制PPARα信号，促进肝脏脂肪酸氧化，而回补PPARα后，正常情况下要纳入VLDL分泌出肝脏的TG就会被氧化，降低血浆TG水平，因此这里说抑制PPARα可能促进TG分泌，引发高血脂）；此外，缺失ACC1/2还可能激活糖酵解、细胞增殖和肿瘤发生等。然而，抑制ACC后为何会出现这些意料之外的作用仍不清楚。本文中，研究人员做出假设，抑制ACC后，丙二酰辅酶A合成减少，进一步通过代谢物介导的机制引发其他反应，并利用药物抑制ACC或肝脏特异性双敲除ACC1/2基因（LDKO）小鼠模型验证了该假设并探索了具体机制，发现肝脏ACC活性降低后，丙二酰辅酶A水平降低，在进食状态下通过激活CPT-1，促进丙酮酸羧化酶活性从而促进糖异生；而在禁食状态下通过调控蛋白质稳态促进氨基酸水平增加，进一步激活糖异生，阐明了代谢物丙二酰辅酶A在调控肝脏代谢中的重要作用。
敲黑板啦！
1.抑制ACC通过促进CPT-1和PC促进进食小鼠的糖异生；
2.抑制ACC促进禁食小鼠回补反应和糖异生；
3.蛋白稳态的适应性变化介导ACC在禁食期间的作用；
4.抑制ACC可以激活肝脏Nrf2，可能调控蛋白质适应性变化。
研究结果
1.在进食状态下，ACC基因缺失会减少肝脏脂肪生成并激活β-氧化
研究人员发现，肝脏ACC1/2基因缺失会导致肝脏丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）水平显著降低（图1B），已知丙二酰辅酶A是DNL（从头脂肪合成）的底物，其减少可降低DNL并刺激脂肪酸氧化。为了检测肝脏特异性敲除ACC1/2基因小鼠（LDKO小鼠）肝脏的脂质合成，研究人员给正常饮食的WT和LDKO小鼠饮用2H2O，然后用1H和2H NMR光谱（核磁共振光谱）进行分析，通过1H和2H的富集程度来量化新TG（甘油三酯）的含量和来源（DNL、伸长、去饱和及酯化）（图 S1A）。实验结果表明，与WT相比，LDKO小鼠肝脏中的总脂肪酸含量下降，包括二十二碳六烯酸（DHA）、ω-3脂肪酸和其他PUFAs（多不饱和脂肪酸）（图1C，S1B、S1D和S1E），且LDKO小鼠肝脏TGs的甲基、α2和烯烃中氢位置的2H富集减少（图S1C和S1F），这与LDKO小鼠肝脏DNL、伸长和去饱和水平受到抑制的结果相对应（图1D和S1G）。与之相反的是，在LDKO小鼠肝脏中甘油上富集的2H和新酯化的TG上富集的2H水平增加（图 S1H）。这与研究人员之前的发现一致，即ACC的缺失抑制了DNL，但促进了FA酯化和TG分泌（小编注： TG分泌指肝脏TG与磷脂、胆固醇和载脂蛋白结合生成VLDL，分泌进入血液循环的过程，这是肝脏TG分泌到血液中的主要形式），这些影响伴随着脂肪组织中脂肪生成基因的上调（图S1I）。研究人员还发现，LDKO肝脏中的中链和短链酰基肉碱比例更高（小编注：脂肪酸β氧化过程的关键酶为CPT1，负责催化胞质中的脂酰辅酶A转化为脂酰肉碱，转运到线粒体内，进行氧化分解。因此研究人员检测脂酰肉碱水平，来评估肝脏中CPT1活性和β氧化水平），这提示LDKO小鼠肝脏中CPT1活性和β-氧化水平升高（图1E）。随后研究人员对LDKO小鼠禁食后再进食，结果显示，LDKO小鼠血浆和肝脏中酮体水平显著升高，且LDKO小鼠肝原代细胞上也证实了酮体生成的增加（图1F-H）。最后，为了证实这一现象是由肝脏ACC抑制而引起的，研究人员用不同剂量的MK-4074（一种肝脏特异性ACC1/2抑制剂，在人类和小鼠中已证明可抑制DNL）处理WT小鼠，结果显示MK-4074处理2h后显著促进小鼠血浆中酮体含量，且呈剂量依赖性（图1I）。这些数据表明，肝脏ACC介导的丙二酰辅酶A生成对于促进DNL途径和抑制FA氧化途径至关重要。
图1.肝脏ACC缺失可抑制DNL并诱导小鼠的酮体生成
图S1.脂质代谢的1H和2H NMR分析
2.在进食状态下，丙二酰辅酶A可抑制肝脏GNG（糖异生）
研究人员发现，在HFD饮食下，LDKO小鼠肝脏脂质积累水平下降，且机体胰岛素敏感性增加（图S2A-B）；但HFD饮食下LDKO小鼠的血糖水平并没有变化，而LDKO小鼠在正常饮食下血胰岛素水平显著升高，且肝脏糖异生基因表达受到抑制（图2A-C），这表明肝脏敲除ACC提高了胰岛素对GNG的调控作用。为了评估肝脏特异性缺失ACC对糖异生影响，研究人员对NCD和HFD饲喂的WT和LDKO小鼠进行腹腔乳酸/丙酮酸（比例为10:1）耐量试验（LPTT）（小编注：LPTT实验中的乳酸与丙酮酸比例为10:1，与体内的生理比例相似，这可维持正常生理状态下的细胞氧化还原水平，同时为肝脏糖异生反应提供底物，以评估小鼠肝脏糖异生水平），结果显示LDKO小鼠肝脏糖异生水平增强（图2D-E）。为了证实这一结果是肝脏ACC抑制所引起而非LDKO小鼠的代偿效应，研究人员用MK-4074治疗WT小鼠，结果显示MK-4074治疗2h后以剂量依赖的方式降低了肝脏丙二酰辅酶A含量，并促进小鼠肝脏糖异生水平（图2F-G），这表明肝脏丙二酰辅酶A可抑制肝脏糖异生。
为了定量检测小鼠体内肝脏葡萄糖的产生，研究人员给WT和LDKO小鼠颈静脉导管注入2H2O，并注入[3,4- 13C2]葡萄糖和[U-13C3]丙酸。在这个实验中，2H标记了葡萄糖的特定位点，反映各来源物质在葡萄糖产生过程中的贡献率。例如，所有途径生成的葡萄糖都会在葡萄糖C2位置标记2H，但C5位置只能在GNG过程中被标记2H，而C6位置只能在通过TCA循环时产生的葡萄糖被标记2H（图2H）。该方法克服了13C示踪剂在TCA循环中的不确定性，其准确性此前已通过体内糖原成像得到验证，并且当PEPCK或PC缺失后，C6上明显缺少2H标记，这同样验证了其准确性。[3,4- 13C2]葡萄糖的独立追踪使得葡萄糖的产生及其部分来源可以用绝对速率来表示。研究人员对WT和LDKO小鼠血浆葡萄糖的6个C进行气相色谱-质谱（GC-MS）来量化同位素标记水平（图S2C），并通过代谢通量分析（MFA）构建回归模型（图S2D），实验结果与预测的质量同位素分布（MIDs）非常吻合（图S2E），LDKO小鼠中所有来源的内源性葡萄糖生成量均升高，包括通过TCA循环的前体（如丙酮酸和氨基酸）产生的GNG增加（图2I）。因此，虽然LDKO小鼠肝脏糖异生基因表达降低，但LDKO小鼠肝脏丙二酰辅酶A水平的下降促进了GNG。（小编注：丙酸可转化为琥珀酰辅酶A，进入到TCA中，参加糖异生。因此[U-13C3]丙酸可反映TCA循环相关产物对葡萄糖产生的贡献）
图2.肝脏 ACC1/2缺失会促进小鼠的GNG
图S2.血浆葡萄糖质量同位素的代谢通量分析
3.进食小鼠肝脏丙二酰辅酶A合成通过抑制LCFA（长链脂肪酸）氧化来调节TCA循环、PC活性和GNG
研究发现，FA氧化通过激活PC、增加ATP的产生抑制糖酵解，而急性诱导肝脏GNG（图3A）。研究人员在上述示踪剂输注期间评估了LDKO小鼠体内PC通量和TCA循环周转率（图2H）。示踪剂如[U-13C3]丙酸或[U-13C3]乳酸可进入TCA循环中，在TCA循环中间产物中生成13C同位素标记，进而进入GNG途径中，从而可通过分析血浆葡萄糖中13C3标记来量化TCA循环。结果显示，LDKO小鼠肝脏PC水平和TCA循环通量显著升高，且ATP产生和利用率也显著增加（图3B-C）。研究人员还发现，与NCD饮食小鼠相比，HFD饮食显著提高了WT小鼠肝脏AMP/ATP水平，但不影响LDKO小鼠肝脏AMP/ATP水平（图S3A），且LDKO小鼠肝脏乙酰辅酶A和柠檬酸水平也显著升高（图3D-E），这两种物质分别可变构激活PC 和抑制PFK（磷酸果糖激酶），进而促进GNG。与之前的研究一致，肝脏乙酰辅酶A的增加也促进了总蛋白质乙酰化水平（图S3B），尽管特异性组蛋白乙酰化并不显著（图S3C和图3D）。综上，肝脏ACC的缺失可促进FA氧化，进而提高乙酰辅酶A和柠檬酸水平，促进GNG。
接下来，研究人员在小鼠原代肝细胞（PMHs）中进一步探究CPT-1介导的LCFA氧化是否会促进LDKO小鼠的GNG。首先，研究人员通过监测柠檬酸中13C同位素水平来评估LCFA氧化水平（图3F）。首先，在LDKO小鼠和MK-4074治疗小鼠的PMHs中加入[U-13C16]棕榈酸酯，结果显示LDKO和MK-4074的PMHs中M+2柠檬酸水平显著升高，而依托莫西抑制CPT-1活性后，显著降低了LDKO和MK-4074的PMHs中的M+2柠檬酸水平（图3G）。与此相反，由[1-13C]辛酸转化为M+1柠檬酸的过程不需要CPT-1的调控，因此LDKO和MK-4074的PMHs中M+1柠檬酸水平无明显变化，且依托莫西抑制CPT1也不影响M+1柠檬酸水平（图3H）。随后，研究人员发现LDKO和MK-4074的PMHs中葡萄糖生成显著升高，而依托莫西处理后显著抑制了LDKO和MK-4074的PMHs的葡萄糖生成（图3I-J）。最后，研究人员检测了CPT-1介导的LCFA氧化是否介导[U-13C3]乳酸/丙酮酸进入TCA循环（图3F），发现在LCFA存在的情况下，LDKO和MK-4074的PMHs中M+3柠檬酸含量高于前体（M+3乳酸）（图3K）。而用依托莫西抑制CPT-1或用辛酸处理后降低了M+3柠檬酸水平（图3L-M）。此外，研究人员发现LDKO小鼠肝脏TCA循环的中间产物水平升高，且MK-4074处理后也可以剂量依赖的方式促进肝脏TCA循环中间产物水平，而依托莫西抑制CPT-1或肝脏特异性敲除PC基因显著抑制了这一现象（图3N-P，S3E）。因此，肝脏ACC的缺失可通过促进CPT-1介导的LCFA氧化来激活PC，进而促进 GNG。（小编注：研究人员是根据标记13C的碳原子个数来判断柠檬酸的来源。如图3F所示，[U-13C16]棕榈酸酯中16个碳原子均含有13C标记，利用[U-13C16]棕榈酸酯处理PMHs，棕榈酸经β氧化产生乙酰辅酶A，此时乙酰辅酶A的2个碳原子均会标记13C，乙酰辅酶A进入TCA循环产生柠檬酸，因此来源于[U-13C16]棕榈酸的柠檬酸为M+2柠檬酸，结果显示LDKO和MK-4074的PMHs中M+2柠檬酸水平升高，且利用依托莫西抑制CPT1，降低了LDKO和MK-4074的PMHs中的M+2柠檬酸水平，表明肝脏AAC缺失可促进CPT1介导的脂肪酸氧化；[1-13C]辛酸中只有1个碳原子标记13C，通过转化为乙酰辅酶A，进入TCA循环产生柠檬酸，此时来源于[1-13C]辛酸的柠檬酸为M+1，[1-13C]辛酸转化为M+1柠檬酸的过程不需要CPT-1的调控，因此LDKO和MK-4074的PMHs中M+1柠檬酸水平无显著变化；[U-13C3]乳酸/丙酮酸中的3个碳原子均标记为13C，其3个碳原子均进入TCA循环并掺入到柠檬酸中，因此来源于[U-13C3]乳酸/丙酮酸的柠檬酸为M+3，在LCFA存在的情况下，LDKO和MK-4074的PMHs中M+3柠檬酸含量升高，且用依托莫西抑制CPT-1或用辛酸处理后降低了M+3柠檬酸水平，说明肝脏ACC缺失可通过促进CPT-1介导的LCFA氧化来激活PC）
图3.肝脏ACC1/2失活可通过增加CPT-1介导的FA氧化来促进GNG、TCA 循环代谢和丙酮酸水平
图S3.肝脏能量和乙酰化概况
4.ACC1/2基因缺失可提高禁食期间血糖水平和肝脏TCA循环中间体含量
过夜禁食会降低肝脏丙二酰辅酶A含量（图4A），这可能会挽救LDKO小鼠表型。令人惊讶的是，禁食处理后，LDKO小鼠空腹葡萄糖水平显著升高，且在禁食期间LDKO小鼠可抵抗血糖的正常降低，但LDKO小鼠肝脏糖异生基因表达无明显变化（图4B-C和图S4A），提示LDKO小鼠抵抗禁食期间血糖下降并不是由基因调控，而是一种代谢调控机制。利用依托莫西抑制CPT-1显著降低了禁食期间LDKO小鼠血糖水平（图S4B）。然而，禁食状态下WT和LDKO小鼠肝脏乙酰辅酶A水平无明显差异（图4D），因此LDKO小鼠肝脏中PC活性可能并未激活。但是，禁食后LDKO小鼠肝脏TCA循环中间产物水平升高（图4E和图S4C），这与进食状态下的结果类似。并且，禁食后LDKO小鼠肝脏乳酸和丙酮酸水平也显著升高（图4F），这表明禁食后LDKO小鼠肝脏的底物供应水平增加或者底物利用率降低。为了检测禁食后LDKO小鼠肝脏乳酸和丙酮酸增加的原因和作用，研究人员对禁食WT和LDKO小鼠肝脏灌注乳酸和丙酮酸，结果显示，与WT小鼠相比，灌注乳酸或丙酮酸后显著促进了LDKO小鼠肝脏的葡萄糖生成（图4G），这表明禁食后LDKO肝脏乳酸和丙酮酸的升高源于底物供应的增加而不是利用率的降低。此外，与LDKO小鼠相比，在LDKO小鼠中敲除PEPCK-C基因显著降低了血糖水平。因此，禁食后LDKO小鼠空腹血糖升高需要GNG，且GNG的升高与底物供应水平的增加相关（图4I）。
图4.禁食减轻了ACC1/2缺失对丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的影响，但对血糖和TCA循环中间产物没有影响
图S4.糖异生基因表达及CPT-1抑制对血糖的影响
5.内源性丙酮酸促进禁食LDKO小鼠回补反应和糖异生
研究人员通过在禁食LDKO小鼠上注射50%[U-13C3]乳酸/丙酮酸测试了体内回补反应（小编注：回补反应(anaplerotic reaction)是指酶催化的，补充柠檬酸循环中间代谢物供给的反应，例如丙酮酸经丙酮酸羧化酶催化，生成草酰乙酸的反应。也可泛指某一代谢系统所必需，且继续为该代谢系统以外的系统消耗进行补充的物质反应）（图5A）。结果表明，LDKO小鼠的血糖反应升高并依赖于肝脏PEPCK-C（图5B），此外禁食状态下WT和LDKO小鼠注射未标记的乳酸/丙酮酸后血糖反应一致（图S5A）。然而，LDKO小鼠血浆葡萄糖C4-C6（源自单个三糖前体）的富集程度较低（图5C），表明存在未标记的葡萄糖碳源。同样，乳酸的富集也较低（图5D），表明葡萄糖13C可能来自内源性丙酮酸。因此，通过前体产物分析来评估血浆葡萄糖的碳源，如图5E所示，以碳源分数（图S5B）或各种来源的葡萄糖浓度（图5F-5I）表示。血浆葡萄糖原子百分比富集（APE）相对于肝脏乳酸APE表明，LDKO小鼠从所有丙酮酸来源产生的葡萄糖量增加（图5F）。与预期相符，由于WT和 LDKO小鼠接受的乳酸/丙酮酸剂量相同，因此从外源LPTT碳产生的葡萄糖仅在LDKO小鼠中略有增加（图5G）。而内源性丙酮酸碳源，包括所有与丙酮酸进行交换的代谢物（例如，由先前存在的碳水化合物和氨基酸产生的丙酮酸），是血浆葡萄糖碳的最大来源（图S5B），也是LDKO小鼠葡萄糖浓度升高的主要原因（图5H）。与预期一致，当PEPCK也被敲除时，GNG受到阻碍，这些生成葡萄糖的来源会大大减少。同样，LDKO小鼠血浆中来自非丙酮酸来源(如甘油)的葡萄糖碳的比例最低（图S5B），当PEPCK也被敲除时，该比例最高，但该来源对绝对葡萄糖浓度的贡献不受ACC1/2或PEPCK缺失的影响（图5I）。这些数据表明，内源性丙酮酸为LDKO小鼠空腹血糖增加提供了碳源。
TCA循环中间产物中13C回补前体的稀释程度能表征回补作用和TCA循环的效率。因此，研究人员提取经[U-13C3]LPTT代谢后9种不同肝脏代谢物的19个片段（图S5C），通过检测其在TCA循环碳转换和GNG中的质量同位素13C，构建出13C代谢通量分析（MFA）模型（图5J）。由于所有小鼠输注的[U-13C3]乳酸/丙酮酸剂量相同，因此外源性乳酸进入系统的通量保持一致，这为内源性通量评估提供了高度的确定性（图 S5D）。该分析表明，丙酮酸和谷氨酸/谷氨酰胺的内源性来源为禁食LDKO小鼠回补作用和GNG的增加提供了底物（图5K-L）。前体产物分析和MFA均表明，禁食LDKO小鼠通过过剩的内源性回补前体维持了禁食期间回补作用和GNG的增加（图5M）。
图5.在LDKO小鼠禁食期间，多余的内源性丙酮酸维持TCA循环中间体和GNG
图S5.13C标记的LPTT代谢通量分析数据
6.禁食增加LDKO小鼠肝内氨基酸含量
进入TCA循环的谷氨酸/谷氨酰胺通量增加表明，氨基酸可能导致禁食LDKO小鼠体内回补前体过剩。事实上，当向LDKO小鼠或PMHs供给[U-13C3]乳酸/丙酮酸时，肝丙氨酸富集会被稀释，并迅速与丙酮酸达成平衡（图6A）。研究人员进一步发现，肝脏必需氨基酸（EAAs）和尿素循环氨基酸的含量在进食状态下基本不变，但在禁食时升高（图6B-C）。在LDKO小鼠肝脏中，几种非EAAs的含量也发生了变化，但不如 EAAs 那么显著或规律（图6D）。值得注意的是，肝支链氨基酸（BCAAs）在禁食期间升高，因为与其他EAAs一样，BCAAs在蛋白质分解过程中被释放，但不能直接被肝脏分解。事实上，WT小鼠肝脏中的BCAAs和其他EAAs在禁食期间略有下降，但在LDKO小鼠中则有所增加（图6E）。同样，WT小鼠肝脏丙氨酸在禁食后明显减少，这与GNG对丙氨酸的利用有关，但这种效应在LDKO小鼠中有所减弱（图6E）。体重减轻或体成分的系统效应不能解释氨基酸供给增加（图S6A-B）。此外，研究人员在另一组单独样本中对WT和LDKO小鼠的肝脏和血浆氨基酸进行匹配分析，证实LDKO小鼠肝脏氨基酸升高，但血浆氨基酸没有差异（图6F）。重要的是，LDKO小鼠肝脏维持肝内丙氨酸的能力与BCAA、乳酸和TCA循环中间产物浓度密切相关（图6G）。这些数据表明，LDKO小鼠禁食期间释放的氨基酸有肝内来源。
拓展阅读
禁食与肝脏代谢
禁食是一种较为流行的饮食模式，科学的禁食可以促进机体健康、延缓衰老、防止肥胖。众所周知，禁食后机体血糖降低，导致机体开始动员内部的贮备能量，以应对禁食带来的能量不足。 研究表明，禁食可促进肝脏自噬相关通路的激活，例如禁食可以提高AMPK和mTOR的活性，并且激活FOXO和Nrf2等调控因子的表达，进而促进自噬相关蛋白的表达和合成。自噬的激活可促进肝脏脂肪和蛋白质的分解代谢，进而释放脂肪酸和氨基酸。脂肪酸可进一步转化为酮体，直接为机体供能，而大部分氨基酸为生糖、生酮氨基酸，其即可转化为酮为机体供能，也可通过糖异生转化为葡萄糖为机体供能。
参考文献： [1] Joshua D. Rabinowitz and Eileen White. Science, 2010 Dec 3;330(6009):1344-8.
图6.肝脏氨基酸过剩维持空腹LDKO小鼠的血糖
图S6.肝脏自噬分析及电镜观察
7.蛋白水解导致LDKO小鼠肝内氨基酸和血糖升高
鉴于禁食期间肝内脂肪和氨基酸通过大自噬和蛋白酶体途径释放，于是研究人员对小鼠进行24小时禁食处理，并于第4和20小时给小鼠注射具有高度肝脏特异性的蛋白酶抑制剂——亮抑蛋白酶肽（leupeptin）（小编注：leupeptin是一种广谱的、具有细胞膜渗透性的蛋白酶抑制剂。在2011年发表的Autophagy表明，经leupeptin处理后，LC3b（广泛使用的自噬标志物）的积累率在肝脏最大，在脾脏最低，所以本文研究人员认为其具有高度的肝脏特异性）。在整个实验过程中监测血糖，以检测LDKO小鼠是否需要通过蛋白水解来维持空腹血糖。研究结果表明，蛋白酶抑制使禁食LDKO小鼠的肝EAA和BCAA水平恢复正常（图6H）。此外，蛋白酶抑制使禁食血糖恢复正常（图6I），这与BCAAs的降低有关（图6J）。以上结果表明，蛋白水解导致LDKO小鼠禁食血糖升高。
亮抑蛋白酶肽还可抑制自噬体的溶酶体加工，并通过某些自噬体蛋白（如LC3-II）的积累以及将选择性物质（如p62/Sqstm1）运送到自噬体来评估大自噬通量。研究人员给小鼠注射亮抑蛋白酶肽后（禁食4h/24h），肝脏LC3-II积累，但在两种状态下，LDKO和WT小鼠的肝脏LC3-II都无显著差异（图6K和图S6C）。相比之下，磷酸化的（S351）p62在禁食24小时的LDKO小鼠肝脏中明显累积（图6L和图S6C），表明选择性自噬（比如线粒体自噬）升高。事实上，研究人员通过电子显微镜发现LDKO小鼠肝脏中的线粒体变小（图S6D），与增加的线粒体自噬一致。禁食状态下，独立于自噬体的微自噬和蛋白酶体介导的蛋白水解也会被激活，但分别直接发生在溶酶体或细胞质中。蛋白酶体在LDKO小鼠肝脏中的表达上调，尤其在进食状态下（图S6E）。因此，在禁食期间，LDKO小鼠肝脏氨基酸和血糖升高需要蛋白质分解，这可能涉及特定的蛋白质分解途径，如选择性自噬或蛋白酶体介导，但不能归因于一般的大自噬。
8.ACC活性丧失导致Nrf2的激活
随后研究人员探究了Akt和mTORC1信号通路，因为这些通路会影响肝脏中的氨基酸和蛋白质代谢。研究发现，进食状态下LDKO小鼠肝脏中的Akt磷酸化略有增加，但在禁食/再进食状态下减弱（图7A和图S7A）。然而，通过S6磷酸化显示的mTORC1信号转导正常（图7A和图S7A）。禁食小鼠门静脉注射胰岛素更倾向于诱导LDKO小鼠Akt和mTORC1信号（图S7B）。然而，由于mTORC1的激活可抑制蛋白分解和GNG，这些数据并不能解释LDKO小鼠的禁食表型。
Nrf2是一种对氧化还原反应敏感的抗氧化转录因子，也在自噬、蛋白酶体活性和生长中发挥作用。通过检测Nrf2的靶标蛋白HO-1和NQO1发现，其蛋白表达在进食和禁食的LDKO小鼠肝脏中均显著升高（图7B和图S7A），这表明Nrf2信号转导被诱导。Nrf2活性与肝脏BCAA浓度之间的相关性分析表明Nrf2与氨基酸来源之间存在关系（图7C）。值得注意的是，自由进食的小鼠单次服用ACC抑制剂2小时后，以剂量依赖的方式激发了Nrf2活性，并且与肝脏丙二酰辅酶A水平呈负相关（图7D和图S7C）。Nrf2通常会通过与Kelch样ECH相关蛋白（Keap1）结合而被降解，而这种结合又会被氧化应激阻断。因此，ACC1/2抑制期间的Nrf2激活可能是由于肝脏基础氧化代谢较高（图1和图3）导致。其他氧化还原因子，如胞浆NADH：NAD+（与乳酸：丙酮酸成比例）和NADPH：NADP+（与苹果酸：丙酮酸成比例）与急性ACC抑制后的Nrf2激活相关（图7E）。此外，升高的富马酸也可在相应情况下激活Nrf2（图7F）。最后，磷酸化的p62能有效促进Keap1的自噬降解，其含量在LDKO小鼠肝脏中增加，并与Nrf2的激活相关（图7G和图S7A），这一发现与蛋白酶抑制期间磷酸化p62的过量积累一致（图6L）。图7H总结了在急性和慢性ACC1/2活性丧失期间可能介导Nrf2激活的因素，但确切的机制还需要进一步研究。
图7.对ACC1/2缺失的慢性适应促进了氨基酸的供应和空腹时血糖的升高
图S7.细胞信号、与肝脏大小有关的因素以及蛋白质合成数据
9.丙二酰辅酶A的长期缺失会导致肝脏增大和蛋白质合成增加
研究人员发现，较之WT小鼠，LDKO小鼠的肝脏增大25%（图7I），这不能归因于肝细胞更新、糖原、甘油三酯（图S7D）或脂滴含量（图S7E）。值得注意的是，与WT小鼠相比，禁食导致LDKO小鼠肝脏质量（图7J）和肝细胞大小（图S7F）减幅更大，这表明多余的肝脏质量可能是禁食LDKO小鼠的蛋白水解库。然而，这种情况同样需要LDKO小鼠在进食期间增加肝脏蛋白质合成来补偿禁食期间的蛋白质水解。因此，研究人员使用2H2O作为体内水分示踪剂，并在禁食12小时（基线）、禁食24小时（基线+额外禁食12小时）和复饲（基线+额外进食 12 小时）小鼠肝脏蛋白质裂解物中测定丙氨酸2H富集情况，以测量蛋白质合成情况（图S7H）。LDKO小鼠在基线禁食和额外禁食12小时之间的蛋白质合成正常增加，但复饲期间诱发了更多的蛋白质合成，这也与肝脏大小相关（图7K）。因此，LDKO小鼠在进食期间通过增加蛋白质合成来维持较大的肝脏质量，而在禁食过程中肝脏质量和肝细胞大小减幅更大。
10.ACC抑制剂处理5天只能重现禁食LDKO小鼠的部分表型
为了探究上述小鼠禁食表型是急性代谢还是慢性适应机制，研究人员比较了LDKO小鼠和急性药物ACC抑制剂处理小鼠的表型。首先，研究人员发现与对照组相比，单剂量MK-4074处理2小时的小鼠肝脏中Nrf2下游靶点、TCA循环中间产物和BCAAs显著上调，而禁食后无差异（图7L-N，图S7C和图S7G）。随后，研究人员用MK-4074处理小鼠5天，以探究更长的处理时间是否能重现禁食LDKO小鼠的表型。结果发现，在禁食后，对照组小鼠的血糖下降，LDKO小鼠能维持血糖，但MK-4074处理组小鼠的血糖与对照组无明显差异（图7O）。此外，与对照组相比，MK-4074处理组小鼠的肝脏柠檬酸盐含量升高，但TCA循环中间产物总量没有明显差异（图7P）。同样，与对照组相比，MK-4074处理的小鼠肝脏EAAs总量增加，但上调程度比LDKO小鼠低，而BCAAs含量无差异（图7Q）。重要的是，虽然肝脏大小与空腹肝脏BCAAs相关（图7S），但肝脏大小不受5天抑制剂处理的影响（图7R）。因此，肝脏中ACC1/2的慢性缺失通过调控蛋白稳态和氨基酸代谢的适应性变化，促进了禁食LDKO小鼠肝脏中的TCA循环中间产物和血糖水平，而单剂量ACC抑制剂处理不会急性诱导上述禁食表型，在抑制剂处理5天后才能重现部分禁食表型。
总结
研究人员通过药物抑制ACC或肝脏特异性双敲除ACC1/2基因（LDKO）抑制丙二酰辅酶A合成，发现促进乙酰辅酶A和TCA循环中间产物产生，同时以促进CPT-1激活和丙酮酸羧化的方式促进肝脏氧化代谢和GNG。此外，研究人员还发现LDKO小鼠在禁食后血糖仍能够维持稳定，这是由于禁食期间，肝脏中蛋白质分解产生的氨基酸增多，促进了回补反应和 GNG。而这可能由红细胞核因子2（Nrf2，一种调节抗氧化和蛋白质稳态的转录因子）的慢性激活来调控。然而，长期缺失丙二酰辅酶A也会促进肝脏变大、蛋白质合成增多等。总之，本篇文章中，研究人员发现通过调节丙二酰辅酶A的合成，可以调控脂肪酸氧化，从而调节GNG和TCA循环，并进一步调控代谢反应信号通路从而对肝脏产生深远影响。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.02.004
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