徐凌燕
代谢学人 Cell Metabolism:强健之道:揭秘免疫与运动的默契共舞
2023-12-7 21:57
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代谢学人

Cell Metabolism:强健之道:揭秘免疫与运动的默契共舞


撰文| 陈江榕 马莹 张俊 武霞 胡敏 郭明伟 编辑| 孟美瑶 校对| 张俊

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背景介绍


目前,日益增长的肥胖现象正严重威胁全球人类健康,其中与肥胖相关的代谢紊乱是导致慢性心血管疾病的高危因素。营养过剩和缺乏体育锻炼是肥胖和糖尿病的主要发病机制。多项研究证明,限制热量摄入和持续锻炼的生理干预能够有效预防和治疗代谢紊乱。

然而,运动改善代谢的具体分子机制仍不够清晰,特别是肌肉功能、局部免疫应答调节和运动之间的相互关系目前在很大程度上尚不明确。这三者之间的相互作用涉及局部免疫调节对肌肉完整性、功能和再生之间的相互作用。因此,深入探究肌肉特异性免疫调控机制与肌肉功能、适应能力和再生的关系,对于未来推动针对特定免疫调节靶点的干预具有至关重要的意义。

从免疫学的角度来看,最近在骨骼肌中发现的组织驻留调节性T细胞(Treg)表达特定的T细胞受体(TCR),并具有独特的转录组。Treg特异性表达CD4、CD25和转录因子Foxp3,而Foxp3是它们发育和功能的核心调节因子。与淋巴组织中的Treg相比,非淋巴组织中的Treg,尤其是骨骼肌中的Treg被证明在控制和维持组织稳态和完整性方面发挥关键作用。肌肉Treg高表达双调蛋白(Amphiregulin,Areg),Areg是表皮生长因子家族的一员,其受体为表达于肌肉组织的免疫细胞和卫星细胞(Satellite cells,SCs)上的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)。最近有研究表明,Areg在调控宿主抗性和耐受机制方面发挥核心作用。与其他EGFR配体不同,Areg与其受体的亲和力很低,因此它不会导致受体内化(receptor internalization)、降解以及负反馈循环,而是持续诱导的信号小编注:表皮生长因子受体(EGFR)作为典型的受体酪氨酸激酶(RTK),其表达水平和信号强度在细胞中受到严格控制。当配体与EGFR结合时,受体通过酪氨酸残基的二聚磷酸化,导致下游MAPK级联反应和PI3K-Akt等信号通路被激活,随后调节细胞生长、增殖和分化等过程。被激活的EGFR依赖于网格蛋白介导的机制迅速内化,定位于早期内体中,此时EGFR信号仍被激活。之后,具有强结合力的配体能保持与受体结合,导致它们被分拣到多囊泡体(MVB)的腔内小泡(ILV)中,随后MVB与溶酶体融合,进一步降解受体;具有弱结合力的配体,如Areg,在早期内体中则与受体分离,导致受体循环回到细胞膜上,故而能持续激活EGFR信号通路)


在肌肉-免疫相互作用网络中,IL6是肌肉在运动后分泌的一种关键肌细胞因子。IL6在肥胖相关代谢疾病中发挥促炎性细胞因子功能,与此不同的是,运动后肌肉组织中的IL-6信号传导不会激活TNF-a和IL-1b等促炎信号通路,而是参与了IL-10等抗炎细胞因子细胞信号通路。IL6存在多效性是因为与其结合的受体形式的不同,IL6Ra存在两种形式,一种是与膜结合的IL6Ra(mIL-6Ra),另一种是由ADAM17水解所形成的IL-6Ra(siIL-6Ra)。在具体机制上,存在经典信号转导通路和反式信号转导通路两种方式。在经典信号通路中,IL6可以与膜结合受体IL6Ra结合之后再与糖蛋白130(也称为gp130或IL6Rβ)结合,激活JAK信号通路。但只有少数细胞表达IL6Ra,几乎所有细胞都表达gp130,因此还存在反式信号转导通路,在该信号通路中, IL6与sIL-6R结合形成复合物,随后该复合物与细胞膜上的gp130结合,可以使不表达IL6Ra的细胞响应IL6,进而开启细胞内的信号转导。在功能上,经典的IL-6信号通路对组织具有一定的保护性、再生性和抗炎性,其通过抑制TNF-a、IL-1,激活IL-10来发挥抗炎作用。而sIL-6R与IL-6复合物诱导细胞分泌趋化因子,如CC-趋化因子MCP1,诱导单核细胞募集到发炎区域来激活免疫系统。此外,T 细胞上的反式信号转导通路导致抑制细胞凋亡、抑制 Treg 分化和 TH17 细胞的分化。尽管两种信号通路皆是通过gp130进行传导,然而不同的细胞类型可能导致IL6发挥相反的功能。由于IL6R仅表达在免疫细胞和肝细胞中,这些细胞只能通过经典信号通路来响应IL6,在小鼠肝再生、慢型肠炎疾病模型中,抑制经典信号通路会导致肝再生受损、阻碍肠炎的发展,因此认为经典通路与抗炎、促再生有关。但是gp130几乎存在于所有细胞上,所以反式信号转导更为广泛。同时,在小鼠肠炎等几种由于炎症导致的疾病模型中,抑制反式信号转导则会导致疾病的改善,因此认为反式信号通路与促炎有关。

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尽管如此,目前仍不清楚运动是否调节肌肉Tregs及其功能,并且从代谢角度和肌肉功能、肌肉发生和修复机制的角度来看,Tregs是否调控肌肉对运动的响应。此外,这种免疫调节在肌肉中的分子机制尚不明确。为了回答上述问题,研究人员使用T细胞和肌肉特异性功能丧失模型,包括选择消除Tregs证明该类细胞控制肌肉功能,同时表明耐力运动能持续诱导具有高功能活性的肌肉驻Foxp3+ Tregs细胞。在分子机制层面,研究人员证明了T细胞上的IL6Rα信号通路能够提升Foxp3+Treg细胞水平,并促进运动和损伤后的肌肉功能修复。为了进一步探究IL6Rα信号通路与肌肉Treg细胞之间的关系,作者构建了小鼠T细胞特异性敲除IL6Rα模型(IL6Rα TKO),并与野生型小鼠对比后发现,IL6Rα TKO小鼠诱导肌肉损伤后肌肉功能下降更为明显。此外,IL6Rα TKO小鼠在稳态下卫星细胞(SCs)和纤维脂肪生成祖细胞(FAP)的含量显著降低,并且在肌肉组织损伤后肌肉再生和功能受损。对野生型(WT)小鼠采用抗IL6R抗体靶向IL6Rα信号通路则会导致IL6Rα TKO小鼠类似的表型,表明抗IL6R抗体促进肌肉无力。这些发现证明了在T细胞上IL6Rα信号轴的关键功能,它可以串联Treg细胞-肌肉细胞的调节网络,调控肌肉功能和再生。

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敲黑板啦!

1. 运动诱导功能性强且稳定的肌肉Treg表型

2. Tregs需要IL6Rα信号来控制肌肉组织的功能和再生

3. IL6R的药理学阻断引起肌肉无力。



研究结果


氧化型比目鱼肌比糖酵解型肌肉含有更多的Foxp3+Treg

首先,为了探究肌肉驻留Treg是否调控肌肉功能以响应运动训练,研究人员探究了16周龄雄性C57BL/6J小鼠肌纤维亚型在久坐稳定状态下的含量。根据肌纤维的代谢特征,作者重点研究了比目鱼肌(Sol,主要是氧化肌纤维),趾长伸肌(EDL,主要是糖酵解肌纤维),胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GC,混合肌纤维)。研究人员通过一组免疫细胞标志物,直接鉴定了从这4种不同肌肉中分离的CD4+T细胞亚群(图1A;流式门控策略参见图S1A)。结合Treg的核心转录因子Foxp3的细胞内染色结果,研究人员发现与其他骨骼肌相比,氧化型骨骼肌Sol中的Treg含量最高(图1 B和1C)。

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图 1|骨骼肌中CD4+ T细胞和Foxp3+ Treg细胞的分群和肌肉对运动的反应


自主跑轮运动可诱导与肌肉修复相关的成肌转录因子和细胞因子

为了探究Treg在运动训练中调控肌肉功能的作用,研究人员选择了自主跑轮(Voluntary wheel running)的运动方式,因为相比于强迫跑台运动,自主跑轮对小鼠的刺激更少,由此产生的效应也可能更符合生理条件。于是,作者将雄性C57BL/6J小鼠随机分为静息组和运动组。在初步实验中,小鼠保持久坐或使用跑轮10天,以此来评估运动训练的直接影响。结果显示,小鼠主要在夜间活动,并且适应了跑轮后表现出较高的活跃度(各个小鼠的活动特征见图S1B)。

为了确定与肌肉代谢、肌肉发生和组织修复相关的运动反应模式,研究人员对Sol肌肉进行了基因表达分析。短期运动训练显著诱导了与肌肉生成相关的标志物的基因表达(包括Myf5Myog;图1D)。此外,经典的肌源性因子IL-6以及编码Areg的Areg mRNA表达水平在运动后显著增加(图1 D)。在短期运动期间,包括己糖激酶2 (Hk2)在内的代谢标志物在mRNA水平上没有显著改变(图1 D)。


耐力运动改变了包括体重在内的代谢状态

接下来,研究人员探究了肌肉中驻留Treg在调控肌肉功能方面的作用。他们在已建立的4周自主跑轮运动模型(运动组)的基础上,让部分运动组经历了更长时间的休息阶段(运动-休息2周/4周组,pre-ex)小编注:研究人员将先运动组又细分为两组,其中一组先运动4周,然后休息2周,另外一组是在4周的跑轮运动后休息4周。研究人员评估了静息组、运动组、运动-休息2周组和运动-休息4周组的肌肉琥珀酸脱氢酶(SDH)活性,来估算氧化能力,并评估在该模型中实验组是否存在肌肉失调。研究人员对GC肌肉小编注:由于SOL是氧化型肌纤维,SDH染色会显示几乎所有肌纤维都是SDH阳性,不能用来评估运动对氧化能力的影响。而GC是混合型肌纤维,因此研究人员选择研究GC评估运动后糖酵解型肌纤维向氧化型肌纤维的转变数量,以判断运动对代谢状态的影响) 冰冻切片进行SDH染色后发现,与久坐的动物相比,小鼠经过4周自主跑轮运动后其SDH+氧化肌纤维的数量轻微增加(图S1C和S1D)。在移除跑轮并经过2周休息期后,研究人员发现SDH+肌纤维类型没有显著变化(久坐时SDH+肌纤维的平均百分比为40.20%;运动组为45.17%;运动-休息2周为45.37%)。在休息了4周后,SDH+肌纤维的平均百分比恢复到静息的基线水平(图S1D)。重要的是,在休息两周后,肌肉免疫记忆表型显示肌肉中Foxp3+Treg细胞显著增加,并且Foxp3+细胞中的增殖型Ki67+Tregs细胞略有增强(图S1E和S1F)。

在观察到上述发现后,研究人员进一步修改了小鼠的运动方案,即跑步4周,然后休息4周。修改后的方案能够更为详细地研究运动训练对免疫的影响以及肌肉-免疫细胞的相互作用。于是,他们将雄性小鼠随机分为久坐组,运动组和运动-休息4周组(后文简称Pre-ex)。Pre-ex组小鼠在前4周可以使用自主跑轮,而运动组小鼠只在最后4周使用跑轮。在整个研究期间定期对代谢参数进行评估,他们监测了体重,发现运动可以显著减少BW的增加(最终BW的变化为:久坐组,3.646±1.189g;运动组,2.896±2.075g;Pre-ex:3.690±0.776 g;4周时,运动组、久坐组和先运动组的体重变化差值为-0.59 g;8周时,久坐组与运动相比,体重变化的差值为-0.75 g;图S1G)。此外,与久坐组相比,运动导致内脏脂肪垫的重量显著下降(图S1H),而运动小鼠的肌肉质量没有明显变化(图S1I和S1J)。每笼每天平均跑步距离为16 km(图S1K)。

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图S 1|自主跑轮实验的生理参数



耐力锻炼诱导肌肉中的Foxp3+Treg细胞数量上升

为了确定运动训练对肌肉驻留型Treg数量的影响,研究人员在8周的实验结束后直接从Sol和GC中对Treg进行流式分析,并分为久坐、运动和Pre-ex组(图2A和2B;Tregs分析的门控策略如图S1L所示)。运动后的Sol和GC肌肉中的Treg数量显著增加,并且Pre-ex小鼠中的Treg数量最多(图2C、S2A和S2B)。肌肉Tregs在pre-ex组中显著增加,强调了运动稳定诱导Treg产生。此外,这些研究结果表明,Treg的数量在运动结束后仍能维持,因此支持了前文中运动对肌肉Treg的免疫记忆效应的概念(图2C和2D)。

为了深入了解Treg在运动结束后的维持情况,研究人员首先检测了它们的增殖潜力。对增殖标志物Ki67的分析表明,运动结束后,Pre-ex小鼠的肌肉驻留型增殖的Treg数量显著增加(图2D)。这些发现表明,运动时的局部肌肉组织环境有助于支持肌肉Treg的特定扩张。

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图 2|运动增加肌肉Treg数量并诱导组织Treg的表型成熟


运动增强CD4+T细胞分化为Treg的潜能

接下来,研究人员想要了解运动对Treg分化的影响。因此,他们提出了一个问题,即运动是否可以通过调节T细胞所在的局部微环境来调节CD4+T细胞分化为Treg的潜能。为此,他们使用了来自腘窝淋巴结中高纯度CD25- CD44lowCD4+T细胞作为原代细胞进行体外分化(小编注:腘窝淋巴在机体的腘窝处,即位于膝关节后方。腘窝处的淋巴比较富集,如果进行过度的运动,造成局部肌肉拉伤,或者浅表软组织伴有感染时,都有可能造成局部淋巴结增生、肿大)。结果显示,与其他实验组相比,Pre-ex小鼠的CD4+T细胞向Treg分化的潜能显著增强(图S2D)。这些发现表明,运动促进诱导CD4+T细胞分化为Treg。


运动介导的Foxp3+Treg参与Areg/EGFR/ST2信号传导

接下来,研究人员探讨了除了诱导肌肉中Treg分化外,运动训练是否也会影响它们的表型特征和功能成熟,以维持组织稳态。具体而言,研究人员考虑到Areg在支持肌肉完整性和修复中的关键作用,于是分析了所有实验组中Treg特异性的Areg表达。值得注意的是,在pre-ex小鼠的Sol和GC中,研究人员发现Areg+Foxp3+Treg细胞亚群显著增加(图2E和S2C)。当包括Treg在内的CD4+T细胞被激活时,它们上调了EGFR,部分通过STAT5(signal transducer and activator of transcription 5,信号转导与转录激活因子5)介导的信号传导。研究表明,Areg表现出与其他EGFR配体不同的结合能力,与其他EGFR配体相比,它以异常低的亲和力结合EGFR。研究人员发现在运动结束后,GC中的EGFR+Treg下降,而pre-ex组在Sol和GC两种肌肉中EGFR+Treg细胞显著增加(图2F)。

为了了解运动介导的细胞相互作用是否牵涉到局部Treg,研究人员重点研究了ST2,它是IL33的受体,属于跨膜受体,并且相比于其他淋巴细胞,ST2在Treg中的表达显著上调。与久坐组和运动组小鼠相比,Pre-ex小鼠的GC中ST2+Tregs比例显著增加(图2G)。在三个实验组中,Sol中的ST2水平保持不变。这些发现再次表明,与氧化肌纤维和混合肌纤维相关的肌肉特异性代谢亚型可以影响(1)包括上述的增殖潜能在内的局部Treg特征;(2)ST2的表达(图2G)。考虑到IL-6作为一种在运动反应中重要的肌源性因子,研究人员测量了T细胞上的IL-6Rα的表达情况。Pre-ex组小鼠的T细胞IL-6Rα表达显著增加(图2H)。综上所述,在Pre-ex组小鼠的肌肉中存在强烈的促进免疫耐受性的环境,导致肌肉Treg的表型和功能成熟,并参与Areg/EGFR/ST2和IL-6Rα信号转导。

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图S2| 运动对肌肉驻留型CD4+T细胞的影响


敲除Treg会消除响应运动所需的肌肉特异性基因表达

考虑到运动引起肌肉中Treg强烈且持续的增加,接下来研究人员想要探究Treg是否通过控制肌肉基因表达来响应运动。他们使用了Foxp3 DTR小鼠,并注射白喉毒素(DT)来介导敲除Foxp3+Treg。他们对雄性Foxp3 DTR-和Foxp3 DTR+小鼠均进行了DT注射(图S3A)。如图3A和3B所示,DT的注射可以有效敲除Foxp3 DTR+小鼠肌肉中的Treg(图S3B)。

从机制上来看,选择性敲除肌肉中的Tregs导致运动时代谢(Hk2Ckmt2Cpt1b)和肌生成反应(Myf5Pax7)所需的肌肉特异性基因表达显著减少(图3C)。这些发现表明,局部Treg通过控制运动相关基因的表达和反应性来调控肌肉功能。

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图S 3|Foxp3 DTR小鼠Treg缺失会影响肌肉内环境平衡


 敲除Treg会使肌肉功能受损

接下来,研究人员探究了缺失Treg带来的肌肉功能的生理学影响。急性Treg耗竭不会引发肌纤维类型的转换(图S3D–S3F)。为了探明Treg缺失是否影响响应运动训练所需的肌肉功能,他们检测了敲除Treg后肌肉中柠檬酸合酶的酶活性。柠檬酸合酶是评估肌肉氧化和呼吸能力的关键调节酶和代谢标志物。柠檬酸合酶活性被用作评估运动后骨骼肌对氧化适应的生化标志物,一些研究表明,柠檬酸合酶活性在运动后会增加。重要的是,敲除Treg会导致GC肌肉中柠檬酸合酶活性显著下降(图3D和3E),这表明在局部Treg缺失的情况下肌肉功能降低。Treg缺失后,通过氧化磷酸化(OXPHOS)复合物的蛋白分析表明,线粒体呼吸能力呈降低趋势(图S3C),这与敲除Treg后观察到的柠檬酸合酶活性降低一致。此外,敲除Treg后肌肉横截面积也呈下降趋势(图3F、3G和S3G)。

为了更直接地研究Treg细胞对肌肉功能的重要性,研究人员在选择性敲除Treg前后进行了小鼠肌肉握力测试(使用BioSeb GS3和Bio-CIS进行的四肢握力测试)。值得注意的是,敲除Treg导致最大肌肉握力显著下降(图3H)。这些发现强调了局部Treg在控制肌肉功能和对运动进行反应这两方面的关键作用。

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图 3|敲除Treg会使肌肉功能严重受损


 运动诱导肌肉Treg的增加部分依赖于肌因子IL6

鉴于Treg在调控肌肉对运动的反应中起到关键作用,接下来,研究人员深入研究Treg-肌肉相互作用的运动反应机制。具体而言,考虑到Il6 mRNA在自主跑轮运动中显著上调(如图1D所示),接下来他们想要确定运动诱导的Treg增加是否受到肌源性因子IL6介导。与这一想法一致的是,先前的研究已经证实,运动后肌肉产生的IL6不参与激活TNF-a和IL-1b等经典促炎信号通路,而是促进抗炎细胞因子(如IL-10)的产生。尽管已有这些认知,但肌源性的IL6调控局部Treg对运动反应的机制仍然不明确。为了解答这个问题,他们采用了肌肉组织特异性敲除IL6的小鼠模型。具体而言,他们使用了Myl1 Cre小鼠小编注:Myl1 Cre小鼠表达骨骼肌特异性Myl1(肌球蛋白轻链1)启动子驱动cre重组酶当与含有loxp侧翼序列的小鼠杂交时,序列在骨骼肌组织中特异性敲除,包括腓肠肌、胫骨前肌和股二头肌,而在脑、肝、心脏和胃中没有敲除。MCK-Cre小鼠具有肌酸激酶启动子驱动的Cre重组酶活性,在骨骼肌和心肌中观察到Cre活性。HSA-Cre小鼠具有由人α -骨骼肌动蛋白(HSA)启动子驱动的Cre重组酶活性Cre活性仅限于成人的骨骼肌纤维以及胚胎的体节和心脏的横纹肌细胞)Il6 fl/fl小鼠进行合笼,得到了肌纤维特异性IL6 KO的小鼠模型。通过PCR对Myl1 Cre和Il6 fl/fl等位基因进行鉴定,确认了肌纤维特异性IL6敲除(图S4A)。此外,他们通过qPCR分析,验证了肌肉特异性的IL6敲除,研究人员将内脏脂肪组织、肝脏作为对照,在其中未检测到Il6的表达差异(图S4B)。

从生理学角度来看,肌肉特异性IL6 KO小鼠与相应的floxed对照组小鼠在跑步距离上没有显著差异(图S4E)。在久坐组中,研究人员观察到肌肉IL6 KO小鼠与floxed对照组小鼠的体重存在显著差异(图S4C),说明在未运动的情况下,IL6能抑制肥胖。而在pre-ex组中这种体重差异消失(图S4C),说明运动不仅仅促进肌纤维分泌IL6,还存在其他类型的细胞,如免疫细胞,分泌IL6来维持体重。与久坐组小鼠相比,在pre-ex组中,不论基因型如何,内脏脂肪组织质量都略有减少(图S4D)。

值得注意的是,在缺乏肌源性IL6的情况下, pre-ex组和floxed对照组肌肉中驻留型Tregs呈现相似的增加(图4A和4B)。这些发现表明,肌源性因子IL6并不是运动后肌肉Treg增加所必需的。然而,通过肌肉Ki67染色发现,在肌源性IL6缺失时,pre-ex不会诱导局部Treg的增殖(图4C)。这些结果表明,除了运动时的局部Treg增殖外,其他机制(如Treg诱导或募集等)也有助于运动介导的肌肉Treg的增加。

尽管缺乏肌源性IL6,运动也能诱导Treg百分比增加(图4B)。因此,研究人员想知道运动后功能性Treg的成熟是否需要IL6。值得注意的是,肌细胞因子IL6的缺乏导致pre-ex组 Foxp3+Treg中Areg、EGFR和ST2的特异性上调的缺失(图4D-4F)。因此,这些发现表明,肌源性IL6在引导肌肉组织Treg特征及其功能的上调中发挥了作用。此外,这些结果表明IL6可以与Areg/EGFR-ST2信号相互作用,并引导运动后Treg在肌肉中的成熟和功能。


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图S 4|运动对小鼠肌纤维的影响



10  运动诱导肌肉Treg增加需要IL6Rα信号

研究人员发现,肌源性IL6的缺失并没有消除运动诱导的Treg分化潜力。然而,依赖Areg/ST2/EGFR信号通路的Treg功能成熟需要肌源性IL6。因此,接下来研究人员开始寻找运动后肌肉Treg分化所需的信号通路。为此,他们重点研究了肌肉Treg的IL6受体信号。从组织相互作用的角度来看,运动训练已被证明可以增加骨骼肌上IL6Rα的表达。如图2H所示,pre-ex小鼠GC中Treg的IL6Rα表达显著增强。

基于运动对肌肉Treg中IL6Rα表达的调节,研究人员进一步探究了T细胞IL6Rα的表达是否是运动诱导的Treg增加所必需的。为了从机制上分析这一问题,他们采用了T细胞特异性功能丧失模型。具体而言,他们研究了T细胞特异性敲除高亲和力IL6受体α链的小鼠(Cd4 Cre × Il6ra fl/fl)。为了产生T细胞特异性IL6Rα敲除小鼠,研究人员将Cre重组酶的转录由Cd4启动子(Cd4Cre)控制的转基因小鼠与两侧含loxp位点的Il6ra等位基因小鼠进行杂交。通过PCR来鉴定IL6Rα的T细胞特异性敲除(图S5A),并对淋巴结CD4+T细胞上的IL6Rα染色后进行流式分析再次证明T细胞特异性IL6Rα敲除(图S5B)。

尽管IL6Rα TKO小鼠肌肉中Foxp3+Treg的数量与floxed对照组相比没有差异(图4G),但通过对ST2和Foxp3表达的检测,可以看到缺乏IL6Rα的T细胞中具有成熟功能的Treg比例显著减少(图4H)。这些发现表明IL6Rα信号在诱导肌肉Treg分化方面发挥着重要作用。

接下来,研究人员对IL6Rα TKO与floxed对照小鼠进行pre-ex运动训练,IL6Rα TKO小鼠和floxed对照组小鼠在运动距离上没有显著差异(图S5C)。此外,研究人员发现久坐组和pre-ex组的IL6Rα TKO小鼠之间体重和脂肪量的没有显著变化,并且久坐组和pre-ex的floxed对照组也是如此(图S5D和S5E)。与前文所述一致,pre-ex组的floxed对照小鼠肌肉驻留型Treg显著增加(图4I和图4J)。相反,在T细胞特异性敲除IL6Rα的小鼠中,运动不能够介导的肌肉Treg增加(图4I和4J),并且pre-ex组IL6Rα TKO小鼠Ki67+Foxp3+Treg也没有显著变化。Pre-ex组floxed对照小鼠的肌肉Treg出现增殖上调的趋势(p = 0.08;图4K)。这些发现表明,除了通过Ki67阳性检测到的局部Treg增殖之外,pre-ex floxed对照和IL6Rα TKO小鼠在Foxp3+Treg的显著差异还存在其他因素(图4I和图4J)。

更重要的是,从机制和表型的角度来看,与floxed对照小鼠相比,pre-ex组IL6Rα TKO小鼠中检测不到Areg+、EGFR+和ST2+Foxp3+Treg的增加(图4L-4N)。这些结果表明,T细胞中IL6Rα对于运动诱导的肌肉Treg的增加以及它们的功能活性(包括Areg、EGFR、ST2)增强所必需的。

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图 4|在缺乏IL6/IL6Rα介导肌肉-T细胞相互作用的情况下,运动的促耐受作用消失


11 IL6Rα TKO小鼠局部Treg介导调控的肌肉功能受损

到目前为止,基因表达分析、柠檬酸合成酶活性分析和OXPHOS复合物的蛋白质检测,以及直接测量最大肌肉握力,这些数据表明,Treg的敲除严重破坏了肌肉功能(图3H和S3C)。将这一发现结合运动诱导Treg增加需要T细胞上的IL6Rα信号,接下来,研究人员考虑在一个独立的模型中验证Treg和IL6Rα信号在控制肌肉适应和功能方面的重要性。根据Treg缺失使得肌肉握力显著损伤的结果,他们选择了骨骼肌肌肉质量减少的模型。具体而言,他们选择了葡萄糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎来构建炎症性肌肉萎缩或肌肉减少症的模型。该小鼠模型具有局部、结直肠炎症和全身性炎症,并导致了骨骼肌质量的减少,因此可以在形态学和分子层面模拟肌肉减少症。研究人员在IL6Rα TKO和floxed对照小鼠中均诱导了肌肉减少症(详见图S5H方案)。首先,他们检测了SDH活性,来表征它们的氧化能力,floxed与TKO小鼠的SDH+纤维并有任何显著差异(p =0.643)。此外,DSS诱导的肌肉减少症引起IL6Rα TKO小鼠GC中SDH+肌纤维略微减少,但没有达到统计学意义(floxed小鼠与DSS诱导肌少症的floxed小鼠相比,p = 0.0865;DSS诱肌少症的floxed小鼠与DSS诱导肌少症的IL6Ra TKO小鼠相比,p = 0.0954;图S5J、S5K)。

为了将IL6Rα TKO小鼠的免疫特征与肌肉功能联系起来,研究人员测量了肌肉质量减少模型的握力。值得注意的是,当DSS诱导肌肉减少症时,相比floxed对照组,IL6Rα TKO小鼠的最大肌肉握力下降更为显著(图4O)。在炎症诱导肌肉质量减少模型中的这些发现都证明了T细胞特异性的IL6Rα表达能够介导局部Treg控制肌肉功能。

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图S 5|运动对T细胞特异性敲除IL6小鼠的影响


12 IL6Rα TKO小鼠局部Treg介导调控的肌肉再生潜能受损

前面的研究确定了局部Treg对肌肉功能的直接影响是由T细胞特异性的IL6Rα表达控制的。接下来,研究人员想要了解T细胞特异性IL6Rα的表达是否同样影响肌肉再生的过程。肌肉再生是由包括SCs和FAPs在内的一个动态网络组成的,SCs主要通过分化成肌纤维和自我更新来保护SC库,从而调控肌肉细胞再生。作为间充质基质细胞,FAP在组织再生过程中支持SC分化小编注:纤维脂肪生成祖细胞(FAPs)又称肌肉驻留、血小板衍生生长因子受体-α阳性(PDGFRα+)间充质祖细胞, FAPs是肌肉再生和平衡的关键调节因子,它们与肌纤维和卫星细胞的相互作用有关。在静止肌肉中,FAPs与完整肌纤维的相互作用可防止它们转化为纤维脂肪细胞;当骨骼肌受到损伤时,会引发 FAPs 增殖和蛋白表达的短暂阶段,FAPs通过旁分泌一些因子(如IGF1、IL6、Wnt1、Wnt3A等)来促进肌肉干细胞分化,随后随着细胞凋亡和随后的吞噬细胞清除恢复到基线水平。研究人员使用多色流式细胞术对SCs和FAPs进行分析。SCs鉴定为Itga+Sca1-(隶属于CD31-CD45-细胞),FAPs鉴定为Itga- Sca1+(源于CD31-CD45-细胞;染色示例见图S5L)。如上所述, IL6Rα TKO影响了小鼠肌肉Treg功能成熟。为了评估这种损伤的后果,研究人员分析了这些小鼠在稳态下SCs和FAPs的数量。他们发现,IL6Rα TKO小鼠的SCs和FAPs数量显著降低,尤其是在Sol中降低最明显(图4P和图4Q),Sol是SCs密度最高的肌肉,因此可能是对组织稳态变化易感性最高的肌肉。在pre-ex IL6Rα TKO小鼠中,肌肉横截面积显著减少(图4R,S5M和S5N)。这些发现表明,在T细胞缺乏IL6Rα信号的小鼠中,肌肉再生能力下降,并强调了Treg-肌肉的相互作用在控制肌肉适应、功能和再生中的关键作用。


13 无菌损伤后,Treg调控的肌肉再生能力需要IL6Rα信号

由于观察到IL6Rα TKO小鼠的肌肉Treg在运动后功能成熟受损,并伴有SCs和FAPs数量的降低,因此,下一步研究人员建立了肌肉损伤模型,来进一步探究免疫-肌肉相互作用。为此,他们将甘油注射到floxed对照组和IL6Rα TKO小鼠的肌肉中来诱导肌损伤(图5A)。损伤后4天(dpi),流式分析结果表明IL6Rα TKO小鼠受损肌肉的SCs数量显著降低(图5B,5C和S6A)。浸润性巨噬细胞(MPs)的数量没有改变(图5B),文献表明,促炎性Ly6C+MPs可以转变为抗炎性Ly6C-或CD206+MPs,并在骨骼肌再生后期阶段发挥作用。在本文中,研究人员观察到IL6Rα TKO小鼠的MP极化少数倾向于CD206+MPs(图S6D),但当门控选择Ly6C时没有观察到差异(图S6E),这表明观察到的差异是由Treg功能的改变引起的,而MPs的变化只占很小的一部分。与损伤后SC数量减少的结果一致,T细胞特异性敲除IL6Rα的小鼠肌肉损伤后14天TA肌肉的横截面面积显著变小(图5D)。这些发现证明了T细胞上的IL6Rα信号在Treg功能成熟和损伤后肌肉稳态修复中的重要性。

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图 5|T细胞特异性敲除IL6Rα的小鼠损伤后肌肉再生明显受损

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图S 6|T细胞特异性敲除IL6Rα的小鼠肌肉损伤情况



14 敲除Treg后的再回补可以恢复肌肉功能

接下来,研究人员想要探究Foxp3 DTR小鼠模型中Treg的回补是否可以促进肌肉功能的恢复。为此,他们使用DT特异性敲除了Treg (图6A)。研究人员检测了敲除Treg之前与敲除之后小鼠的肌肉握力,与未敲除Treg时相比,Treg的敲除导致肌肉功能显著下降,表现为小鼠肌肉握力显著下降(图6B)。而Treg的内源性再生(Treg恢复)可以促进肌肉功能的恢复,并达到Treg敲除前的水平(图6B)。这些结果表明局部Treg在控制肌肉力量方面的重要作用。

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图 6|IL-2/IL-2抗体复合体扩增Treg恢复IL6Rα TKO小鼠的肌肉再生能力


15 在IL6Rα TKO小鼠中使用抗IL2/IL2抗体复合物进行Treg增殖以恢复肌肉功能

接下来,研究人员进一步探究了IL6Rα TKO小鼠肌肉修复缺陷是否可以挽救(图4),他们使用抗IL2/IL2抗体复合物进行了功能获得实验和Treg增殖小编注:IL2是T细胞增殖和分化的关键分子,也被称为T细胞生长因子, T细胞在其生长刺激物的存在下一般不能在体外培养中长期存活,加入IL-2则能其长期持续增殖,IL2主要由CD4+T细胞产生,IL-2通过与淋巴细胞表面的IL-2受体结合并传导信号到细胞内。为此,每隔一天腹腔注射6ug抗IL2/IL2抗体复合物至IL6Rα TKO和floxed对照小鼠中(实验方案见图6C)。在注射抗IL2/IL2抗体后,IL6Rα TKO小鼠和floxed对照小鼠的Treg在外周血中表现出相似Treg增殖动力学(图6D)。他们观察到,Treg的增殖可以完全恢复肌肉中减少的SC和FAP数量,并且14天后,IL6Rα TKO小鼠SC和FAP数量恢复到了floxed对照小鼠的水平,再次证明Treg-肌肉存在相互作用(图6E-6G)。


16 药理靶向IL6R会使WT小鼠的肌肉功能受损

鉴于IL6Rα TKO小鼠的肌肉功能受损的表型,接下来研究人员从临床意义的角度进行了探究。具体来说,用于治疗各种自身免疫性疾病的IL6R靶向抗体,如托珠单抗(tocilizumab)都可以诱导肌肉功能损伤。为了在实验上实现这一点,在4周时间内,他们对WT小鼠注射了同型对照抗体或特异性抗IL6R抗体 (实验方案详见图7A)。并通过每周一次小鼠握力测试来测定肌肉功能的受损情况(图7B和S7A-S7F)。在治疗过程中,接受抗IL6R抗体的动物在注射开始后第14天和第21天表现出肌肉力量下降的趋势。在为期4周的实验后,与接受同种型对照抗体的小鼠相比,接受抗IL6R抗体的小鼠的初始肌握力下降了25%,因此现肌肉功能的显著下降。这些结果表明,在药物 IL6R靶向作用下,能够出现与IL6Rα TKO中肌肉功能损伤一致的表型。

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图 7|药物靶向IL6R对WT小鼠肌肉功能损伤

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图S 7|Treg的变化会影响肌肉功能


总结 

肌肉驻留型调节性T细胞(Tregs)调控局部组织的完整性和功能。然而,基于Treg的调控肌肉功能和再生的分子机制仍不明确。本篇文章中,研究人员发现运动诱导了功能性强的肌肉驻留型Treg稳定增加,并提高了双调蛋白(Areg)、表皮生长因子受体EGFR和ST2的表达。在机制层面,T细胞敲除IL6Rα(TKO)导致小鼠Treg调控肌肉再生功能下降,SCs和FAPs数量显著减少,而这些细胞是肌肉再生所必需的。在运动和肌肉减少模型中,IL6Rα TKO小鼠表现出更明显的Treg缺失、功能成熟受阻和肌肉质量下降。肌肉损伤模型表明,IL6Rα TKO小鼠的肌肉再生受损。Treg的重新回补可恢复IL6Rα TKO小鼠的肌肉修复。并且WT小鼠中IL6R的药理学阻断表现出和IL6Rα TKO小鼠一致的肌肉功能损伤,突出了该研究结果的临床意义。

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原文链接:https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.08.010


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