徐凌燕
代谢学人 Cell Metabolism :尊嘟假嘟,组蛋白乳酸化促进肝纤维化?
2023-10-14 15:55
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代谢学人

Cell Metabolism :尊嘟假嘟,组蛋白乳酸化促进肝纤维化?


撰文 | 闪光余 夏志蕊 朱丽君 刘爽 曹玉香 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 刘爽


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背景介绍

在糖酵解中,己糖激酶(HK)通过磷酸化葡萄糖产生葡萄糖6-磷酸来催化其代谢的第一个关键步骤。该反应可以捕获细胞内的葡萄糖,增加了细胞对葡萄糖的利用率。在哺乳动物细胞中有不同基因编码的五种HK同工酶(HK1、HK2、HK3、HK4和HKDC1),其中只有HK2在蛋白质的氨基和羧基末端具有两个活性催化结构域,而HK1和HK3在羧基末端仅具有单个活性催化结构域。先前有研究证明,在糖酵解发生频率较高的细胞中(如癌细胞),即使在有氧条件下也利用HK2的表达来加速葡萄糖代谢。然而,这种加速虽然提供了足够的糖酵解中间体来支持细胞的合成代谢需求,却不可避免地伴随着代谢终产物(如乳酸)的生成。目前,由HK2介导代谢产生的乳酸对生物体的影响还未被阐明。

传统上认为乳酸是葡萄糖代谢的废物,细胞通过排泄将其丢弃。然而,越来越多的证据表明,乳酸作为信号分子、能量底物和免疫调节分子发挥着重要的作用。最近的一项研究发现,乳酸也在一种被称为组蛋白乳酸化的表观遗传改变中发挥着重要作用。有趣的是,组蛋白尾部赖氨酸残基的组蛋白乳酸化修饰直接促进基因转录,类似于研究最广泛的组蛋白修饰—组蛋白乙酰化,但组蛋白乳酸化调节的基因表达特征与组蛋白乙酰化调节的基因表达特征不同。因此,探索组蛋白乳酸化在各种生理和病理过程中的潜在作用,可能会为发现并治疗人类疾病提供新策略。

肝纤维化是肝脏对各种损伤的修复反应,与严重的发病率和死亡率有关。目前,除肝移植外,尚无治愈肝纤维化的有效方法。在肝损伤期间,静息状态的肝星状细胞(HSC)被激活并转分化为α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性的肌成纤维细胞,这是纤维化肝脏中胶原生成的主要原因。最近,有研究表明,代谢重编程(包括有氧糖酵解)已成为HSC激活的一个关键特征,抑制有氧糖酵解可阻止HSC激活。尽管观察到在HSC激活过程中有氧糖酵解的增强增加了乳酸的产生,乳酸与HSC激活相关的潜在机制仍然难以捉摸。

近期发表在Cell Metabolism杂志上的一篇题为“Hexokinase2-mediated gene expression via histonel actylation is required for hepatic stellate cell activation and liver fibrosis”的文章中,研究人员证明了HK2诱导的乳酸是通过组蛋白乳酸化而不是组蛋白乙酰化影响基因表达。研究人员发现在HSC激活的过程中HK2被诱导表达,并且发现随后乳酸的产生促进了诱导其激活过程中基因启动子上的组蛋白乳酸化。这些研究结果表明,通过基因缺失HK2或药物抑制乳酸的生成来减少HSC中的组蛋白乳酸化会抑制其激活,而外源性乳酸补充可以逆转HSC的激活,并且组蛋白乳酸化与组蛋白乙酰化相互竞争。研究人员还通过CUT&Tag技术揭示了H3K18la和H3K18ac在小鼠原代肝星状细胞中的全基因组分布。此外,研究人员发现了小鼠中HSC特异性的HK2缺失或全身性的HK2缺失减轻了HSC的激活和肝纤维化。因此,该项研究表明HK2可能是肝纤维化的有效治疗靶点。

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敲黑板啦!

1.HSC活化过程中HK2诱导组蛋白乳酸化水平升高;

2.H3K18la在HSC激活的关键诱导基因启动子区域中富集;

3.全身性敲除HK2或组织特异性敲除HSC中HK2可改善肝纤维化

4.补充乳酸可以消除HK2缺失抑制的HSC激活,并促进的肝纤维化

研究结果


1.HK2的催化活性可诱导组蛋白的乳酸化,但不诱导组蛋白乙酰化

为了探索HK2的表达以及其催化活性是否影响组蛋白乳酸化,研究人员使用了MI5-4中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,这种细胞内检测不到HK的基因表达并且具有有限的HK活性。研究人员在这些细胞中表达了野生型(WT)HK2以及激酶死亡突变体(SA)HK2。在突变体中,丙氨酸取代了催化活性所需的氨基和羧基末端结构域中的丝氨酸残基(S155A/S603A)。如图1A所示,WT和SAHK2在MI5-4 CHO细胞中表达水平相同。然而,用Seahorse代谢生物分析仪测量细胞外酸化率(ECAR)显示,仅在WTHK2细胞中糖酵解活性显著增加(图1B和1C)。WTHK2细胞的糖酵解活性还导致了乳酸的产生及细胞乳酸水平的显著增加(图1D和S1A)。

为了确定由HK2诱导的乳酸产生是否足以促进细胞中的组蛋白乳酸化,研究人员检测了组蛋白H3赖氨酸18(H3K18la)上的乳酸化,而该赖氨酸残基也被乙酰化(H3K18ac)。有趣的是,H3K18la在空载体(EV)和SAHK2细胞中几乎检测不到,但在WTHK2细胞中却显著升高。而H3K18ac无论HK2表达如何都是可被检测到的,且乙酰化程度在WTHK2细胞中略有降低(图1E)。除了H3K18la之外,研究人员发现H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la也仅在WTHK2细胞中升高(图S1B)。研究人员还观察到非组蛋白的乳酸化在WTHK2细胞中大部分升高,而尽管细胞内的乙酰辅酶A水平更高,非组蛋白大多数的乙酰化在WTHK2细胞中没有增加,甚至还有所降低(图S1C-S1E)。为了进一步阐明H3K18la和H3K18ac的潜在功能,研究人员接下来进行了CUT&Tag实验,它是一种新的全基因组免疫检测方法(小编注:CUT&Tag是研究蛋白质和DNA相互作用的一种较新的分子生物学方法,与ChIP-Seq相比更加简单易行,转座子只在接近蛋白质结合位点的附近切割染色质,从而使DNA序列长度缩短。因此即使较低的测序深度也能得到较高质量的数据,并且其背景信号比大多数ChIP-Seq的背景信号低)。H3K18la和H3K18ac的全基因组分布的分析显示,两种组蛋白修饰主要位于启动子3kb的区域内(图1F和S1F),这与研究人员的免疫印迹测定结果一致。研究人员还观察到在WTHK2细胞中的转录起始位点(TSS)附近的H3K18la峰增加,但H3K18ac峰没有增加,甚至还有略微的降低(图1G)。

为了鉴定由H3K18la和H3K18ac调节的潜在候选基因,研究人员首先通过以先前在巨噬细胞上所做过的研究为标准来比较相同基因的启动子区域的这些组蛋白修饰水平。大多数基因以H3K18la的增加为标志,而在WTHK2细胞中没有任何以H3K18ac作为调节而显著诱导的基因(图1H和1I)。也就是说,没有任何一个基因在WTHK2细胞中仅通过H3K18ac的增加作为调节其表达。因此,尽管HK2的表达通过促进糖酵解来增加乳酸和乙酰CoA的水平,但它仅影响组蛋白的乳酸化。接下来,研究人员以空载体EV和突变体SAHK2细胞为对照,鉴定了在WTHK2细胞中,以H3K18la作为基因表达标记的候选基因共有3003个(图S1G)。

拓展阅读

组蛋白乳酸化

组蛋白是染色质的核心成分,其N端尾部区域存在大量翻译后修饰(如甲基化、乙酰化和磷酸化),可以通过改变核小体结构或招募非组蛋白等方式来调控RNA转录、DNA复制和损伤修复等与基因表达密切相关的生理过程。而乳糖是糖酵解过程中产生的一种丰富的代谢物,在免疫细胞和肿瘤细胞中均可产生。乳酸代谢参与着许多肿瘤疾病过程,肿瘤微环境中癌细胞糖酵解产生的大量乳酸会分泌到细胞外环境中,调节包括细胞侵袭、血管生成、转移和免疫逃避等来促进肿瘤发展。同时,大量的乳酸积累还会导致一系列的炎症损伤,而炎症反应几乎涉及所有器官的急性和慢性疾病,如肝硬化和肝衰竭。

2019年芝加哥大学赵英明教授课题组在Nature上首次报道了组蛋白乳酸化,即在细胞代谢过程中,积累的乳酸可以作为前体物质导致组蛋白上的赖氨酸残基发生乳酸化修饰,进而调控基因的表达,并参与细菌感染的M1巨噬细胞的稳态调控。作为一种新型的蛋白翻译后修饰类型,乳酸化修饰不仅为蛋白质翻译后修饰研究开辟了新的领域,同时也为肿瘤转移侵袭、巨噬细胞维持免疫稳态、炎症、修复和伤口愈合、脂肪分解、血管生成等研究提出了新的方向。

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乳酸参与心血管系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统等疾病的调节

 参考文献:

  [1]Zhang D, et al. Nature. 2019 Oct;574(7779):575-580.
  [2]Li X, et al. Signal Transduct Target Ther. 2022 Sep 1;7(1):305.


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图1 在MI5-4CHO细胞中,HK2的表达诱导糖酵解、乳酸生成和组蛋白乳酸化

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图S1 在MI5-4CHO细胞中,HK2的表达诱导pan-Kla(泛-乳酸化)

2.H3K18la标记的基因参与基因表达和各种代谢过程的调节

为了研究HK2和乳酸如何通过组蛋白乳酸化影响基因表达,研究人员首先通过外源乳酸处理优化组蛋白乳酸化水平。研究人员发现,在对照(EV)细胞中10mM乳酸处理24小时诱导的H3K18la水平与WTHK2细胞中的水平相当(图2A、S2A和S2B)。研究人员接下来进行RNA测序(RNA-seq),用于比较EV、WTHK2和EV+Lac的转录组。研究人员对差异表达基因(DEG)的分析表示,外源乳酸处理所改变基因的表达与WTHK2细胞中观察到的相似,上调1109个基因(WTHK2中68.5%的基因和EV+Lac中62.7%的基因),下调1532个基因(WTHK2中75.6%的基因和EV+Lac中75.0%的基因)(图2B、2C和S2C)。接下来,研究人员鉴定了通过HK2和乳酸处理上调的493个基因,这些基因也在它们的启动子区域被H3K18la标记(图2D)。在研究人员通过GO分析参与的生物过程发现,H3K18标记的基因参与基因表达、RNA和蛋白质代谢过程以及蛋白质修饰过程的调节(图2E)。GOBP 分析排名靠前的信号通路中包含的基因如:包括冠层成纤维细胞生长因子信号调节因子2(Cnpy2),转录延伸(Supt4a), 线粒体转录挽救因子1(Mtres1)、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)和小亲和蛋白1a(Sprr1a)等基因,并利用qPCR检测其在EV、WT HK2、SA HK2和EV+lac 细胞中表达,发现以上基因在WTHK2中高表达(图2F)。此外,在所选基因的启动子处验证了H3K18la和H3K18ac峰,并且在WTHK2细胞中观察到H3K18la峰的显著增加以及H3K18ac峰的略微降低(图2G)。

为了进一步证明HK2的表达和组蛋白乳酸化之间的关系,研究人员在MI5-4细胞中表达了诱导型HK2。根据ECAR和耗氧速率(OCR)的升高,证实了由于诱导型HK2的表达所引起的糖酵解活性增加(图S2D-S2G),而这与研究人员关于HK2的组成表达的发现一致。研究人员还观察到伴随着基因表达的诱导HK2的表达也诱导了H3K18la,而将HK2表达降低至基础水平消除了这种作用(图S2H和S2I)。总之,这些结果证明HK2表达提高糖酵解活性并增加了乳酸产生,而这一过程则是通过H3K18la来影响基因的表达。

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图2 HK2/H3K18la特异性基因参与MI5-4 CHO细胞中基因表达和各种代谢过程的调节

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图S2 乳酸和诱导型HK2表达对H3K18la的影响

3.在活化的小鼠和人HSC中诱导H3K18la 

最近的研究表明,糖酵解增强不仅限于癌细胞,而且在慢性炎症和纤维化过程中糖酵解的增强也发生在肝、肺和肾的成纤维细胞和肌成纤维细胞中。肝损伤后,静息状态的HSC被激活并成为纤维化肝脏中肌成纤维细胞的主要群体。尽管大量研究表明,HSC的活化通过诱导各种糖酵解酶伴随乳酸产生,但乳酸与HSC活化的关系仍未被阐明。基于研究人员在MI5-4 CHO细胞中的上述发现,研究人员假设产生HK2的乳酸可能在HSC活化过程中通过组蛋白乳酸化影响基因表达。为了验证这一假设,研究人员首先证实了HK2在CCl4注射或胆管结扎(BDL)引起的小鼠肝纤维化模型中的表达。研究人员观察到HK2表达主要与纤维化的肝中表达α-SMA的肌成纤维细胞共定位(图S3A和S3D)。研究人员随后评估了HK2与HSC活化诱导基因Col1a1和Timp1的mRNA水平上的相关性,结果发现HK2和HSC活化所诱导基因表达水平之间呈现正相关性(图S3B-S3C,S3E-S3F)。研究人员接下来从小鼠肝脏中分离原代HSC,并通过评估类视黄醇液滴的自体荧光来检查HSC群体的纯度(图S3G)(小编注:超过95%的类视黄醇是以视黄酯的形式存储的,并占HSC细胞质脂滴含量的30%-50%)。研究人员的免疫印迹分析显示,HK2在来自CCl4注射小鼠的肝脏的原代HSC中表达很高,而HK1(其在来自健康肝脏的静息HSC中表达)在活化的HSC中仅被轻微诱导(图3A)。静息状态的HSC在体外培养中可自发活化。同样的,静息状态的HSC中检测不到HK2表达,但在培养3天和7天的小鼠原代HSC中观察到HK2的表达以及α-SMA的高表达(图3B)。研究人员还在来自CCl4注射的小鼠肝脏的原代HSC(图S3H)以及来自BDL小鼠肝脏的HSC(可公开获得的RNA-seq数据集GEO:GSE154170)和体外培养7天的HSC(可公开获得的微阵列数据集GEO:GSE34949)中,在mRNA水平上验证了HK2被稳定诱导表达(图S3I和S3J)。然而,肝脏中的主要HK同工酶葡萄糖激酶(GCK)在小鼠原代肝细胞中表达,但在静息和活化的HSC中不表达(图S3K)。接下来,研究人员发现ECAR、乳酸产量和细胞乳酸水平的测量显示活化的HSC中糖酵解活性的显著升高(图3C和S3L-S3N),导致在体内和体外活化期间的H3K18la诱导(图3D和3E)。重要的是,除了H3K18la之外,H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la在体外活化的HSC中被诱导(图S3O)。与H3K18la不同,H3K18ac存在于静止HSC中,并且其水平在体内活化的HSC中持续升高,但在体外活化期间被抑制,表明HSC的活化可能需要H3K18la而不是H3K18ac。与组蛋白乳酸化和乙酰化一致,研究人员还发现非组蛋白乳酸化主要在体外活化的HSC中升高,但乙酰化降低(图S3P和S3Q)。为了加强研究人员在人类临床背景下的发现,研究人员对肝硬化患者的肝组织进行了双重免疫荧光染色。患者肝脏的免疫染色表明,82.9%±3.1%的α-SMA+细胞表达HK2,63.0%±5.2%的细胞表达H3K18la,78.2%±3.6%的COL1al+细胞表达HK2,并且有66.6%±5.1%的细胞表达H3K18la(图3F),这一结果说明HSC的活化与HK2的表达以及H3K18la存在着联系。总体而言,这些结果表明HK2的表达和糖酵解活性可以经由H3K18la在小鼠和人活化的HSC中发挥作用。

拓展阅读

肝星状细胞的碳代谢重编程

肝星状细胞(HSCs)是一种非实质肝细胞,可以调节肝脏生长、免疫和炎症,以及能量代谢和营养稳态,这些功能都依赖于代谢的多样性和能量消耗的严格控制。而HSC的中心碳代谢重编程在细胞活化中起着重要的作用,因为其上调了糖酵解以满足转化为肌成纤维细胞表型的能量需求。

在永生化的人和小鼠的HSCs中,与细胞内葡萄糖代谢过程相关基因的mRNA表达通常是增加的(如HK2和丙酮酸激酶),这些酶诱导的糖酵解增加通常伴随着糖异生相关基因的下调(如果糖双磷酸酶1)。活化的HSCs增加了丙酮酸脱氢酶激酶3(PDK3)的表达,进而抑制了丙酮酸向乙酰辅酶A转化,导致乳酸的积累。

目前有研究表明,乳酸在HSC代谢中则直接参与了激活和肌成纤维细胞表型的永久化,阻断乳酸在细胞内积累可以抑制其增殖,并且还会抑制与肌成纤维细胞特征相关基因的表达,同时还会诱导脂质积累和脂生成基因。

 参考文献:

[1]Trivedi P,et al. Cell Metab. 2021 Feb 2;33(2):242-257.


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图3 HK2/H3K18la在HSC活化期间被诱导并调节基因表达

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辅图3 HK2和pan-Kla表达被激活的HSC诱导

4.H3K18la在HSC激活的关键诱导基因启动子区域中富集

为了进一步确定H3K18la是否在HSC激活过程的基因表达中起作用,研究人员对从健康新鲜的肝脏中分离培养6天的小鼠HSC进行全基因组CUT&Tag。值得注意的是,活化的HSC中的H3K18la主要分布在启动子区域内(42.5%),而H3K18ac在启动子区域的分布程度则要小得多(27.4%),甚至小于内含子(28.2%)和远端基因间区域(34.5%)(图3G和S3R)。这些发现表明,H3K18la,在诱导HSC活化的基因表达中起主要作用。研究人员通过分析启动子区域鉴定了4070个基因为H3K18la标记的候选基因,117个基因被H3K18la和H3K18ac所共同标记,并且仅20个基因为H3K18ac标记的候选基因(图3H)。因此,活化的HSC中的绝大多数基因在启动子区由H3K18la标记。为了鉴定活化的HSC中的H3K18la标记的基因,研究人员对培养6天的原代HSC中进行RNA-seq,发现在活化期间细胞显著上调的1677个基因和显著下调的1505个基因(图3I)。最后,研究人员鉴定了在启动子区随着H3K18la的诱导而上调的1126个基因(图3J)。GOBP分析揭示了这些H3K18la标记的基因参与细胞粘附、迀移和伤口愈合等过程(图3K),这表明了H3K18la可调节代表HSC特征的关键基因。

为了寻找能在体内适用的新型FSP1抑制剂作为潜在的药物对抗难以治疗的癌症,研究人员验证了大约10000种小分子化合物,使用化学信息学工具来预测其物化性质和药物相似性。进一步通过苗头化合物验证(小编注:也称Hit验证,一种通过高通量筛选技术初步筛选得到具有一定生物活性化合物的研究方法)确认了一类3-苯基喹唑啉酮类化合物(以先导化合物icFSP1为代表)是一类强效的FSP1药理抑制剂(图1a)。初步的构效关系研究尚未发现比icFSP1更有效的化合物(辅图1a)。

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图4 HK2基因的缺失通过减少H3K18la来抑制HSC激活,H3K18la可被外源补充乳酸而拯救

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辅图4 HK2缺失和HK2/H3K18la 对HSC激活相关基因中的生物学功能的影响

5. HK2基因缺失通过减少H3K18la来抑制HSC激活

鉴于研究人员的发现,激活的HSC通过诱导糖酵解、HK2的表达和H3K18la进行代谢重编程(小编注:代谢重编程是指细胞为满足能量需求,改变代谢模式促进细胞增殖和生长的机制,不仅可以帮助细胞抵御外界胁迫,还可以赋予细胞新的功能),研究人员推测HK2的下降通过抑制H3K18la阻碍HSC激活。为了验证研究人员的假设,从HK2f/f小鼠的肝脏分离原代HSC,并感染融合eGFP的Cre重组酶腺病毒(Ad-GFP-Cre),随后培养6天来进行基因缺失(图S4A)。HSC中HK2缺失使ECAR、乳酸产生和细胞乳酸水平降低约60%(图4A-4C和S4B)。OCR也显著减少(图S4C和S4D),表明HK2的表达促进了HSC激活后的糖酵解,而糖酵解的主要途径部分用以提供丙酮酸,丙酮酸在线粒体中还原为乳酸并被氧化。此外,由HK2的缺失引起的这种代谢扰动抑制α-SMA表达和增殖,但不引起细胞死亡(图4D、S4E和S4F)。如研究人员所预期的,WT原代HSC的活化不受腺病毒Cre感染的影响(图4D)。

在鉴定了HK2的减少对糖酵解活性和HSC激活的影响之后,研究人员接下来检测了H3K18la和H3K18ac的水平。有趣的是,HK2缺失的细胞显示出比活化的HSC更低水平的H3K18la和H3K18ac,但外源性乳酸处理恢复了H3K18la,而H3K18ac进一步降低(图4E)。同样地,CUT&Tag结果的热图分析显示在激活的小鼠原代HSC中基因的TSSs附近H3K18la被显著诱导,而这通过HK2缺失而减少,并且在添加乳酸后恢复(图4F)。相比之下,H3K18ac在活化的HSC中减少,并且通过HK2的缺失和乳酸处理进一步减少(图4F)。为了进一步研究H3K18la标记的基因是否依赖于HK2的表达以及乳酸处理,研究人员比较了活化的WT HSC与活化的HK2敲除(KO)的HSC中H3K18la标记的基因的表达。研究人员发现在活化的HK2-KO细胞中下调的基因增加约3倍(图4G)。乳酸处理逆转了依赖于HK2表达的大多数基因的表达(图4H)。GOBP分析显示,依赖于HK2/H3K18la和乳酸处理的这些基因与细胞粘附、迀移、细胞外基质组织和TGF-β受体信号传导途径相关(图S4G),说明HK2/H3K18la在HSC激活诱导的基因调节中的关键作用。实际上,H3K18la峰在HSC激活的关键诱导基因的启动子处高度富集,在静息状态的HSC和HK2-KO的细胞中不是,但HK2-KO细胞中的乳酸处理恢复了H3K18la峰(图4I、4J和S4H-S4J)。与研究人员关于TSS附近的全基因组H3K18ac峰的发现一致,在活化的HK2-KO细胞以及用乳酸处理的HK2-KO细胞中,H3K18ac峰在基因的启动子处被逐渐抑制。

为了评估乳酸和乙酸盐处理是否恢复KH2-KO HSC中的基因表达,研究人员检测了HSC活化诱导基因的转录水平。令人惊讶的是,乳酸处理上调了被HK2缺失抑制的基因表达,但乙酸盐处理没有(图4K)。同样地,活化的HSC的侵袭能力因HK2缺失而减弱,但通过乳酸盐处理得以逆转,但其表型未通过乙酸盐处理恢复(图4L)。总的来说,研究人员的发现显示HK2缺失抑制了HSC激活,并且通过乳酸处理(可能通过H3K18la)可消除这种抑制作用。

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图5 通过抑制乳酸产生或I类HDAC抑制剂处理减少的H3K18la使HSC激活受到抑制

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辅图5 抑制H3K18la使HSC失活

6. 药理学抑制乳酸的产生会抑制HSC的激活

为了研究组蛋白乳酸化和HSC激活之间的关系,研究人员进一步评估了用乳酸的药理学抑制剂治疗后肝星状细胞基因表达的激活。草酸盐和二氯乙酸盐(DCA)由于其调节糖酵解的能力而被评估为抗癌药物。草酸盐通过抑制乳酸脱氢酶(LDH)来抑制丙酮酸产生乳酸,而DCA通过增加丙酮酸向乙酰辅酶A的转化而不是通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶向乳酸的转化来抑制乳酸产生(图5A)。先前有文献报道,草酸盐和DCA处理显著降低乳酸产生和细胞乳酸水平(图5B、5C和S5A),并且这种干预在小鼠原代HSC中抑制细胞增殖而不引起细胞死亡(图5D和S5B)。草酸盐和DCA处理有效地降低了H3K18la引起HSC激活诱导的基因的表达,其通过乳酸补充来逆转(图5E-5H)。为了进一步明确LDH和HK2诱导的组蛋白乳酸化和随后的基因表达之间的直接关系,研究人员将靶向LDH的小干扰RNA(siRNA)转染小鼠原代HSC。与LDH抑制剂处理一致,LDH的siRNA敲低减弱了细胞乳酸盐水平和H3K18la以及诱导HSC激活的基因表达,这可以通过乳酸的处理而恢复(图S5C-S5E)。

TGF-β1被认为是在HSC的纤维化信号通路中发挥重要作用的关键细胞因子。最近越来越多的证据表明,TGF-β1还通过增强HSC和成纤维细胞中的糖酵解通量参与代谢重编程。虽然Lx-2人类HSC被认为是组成性激活的(小编注:组成性激活可理解为生物发育阶段或生物活动中需要基因的持续表达),但TGF-β1进一步激活这些细胞。因此,研究人员研究了TGF-β1对Lx-2细胞活化的影响,和预期相符。TGF-β1增加乳酸产生,该效应被草酸盐和DCA处理减弱(图S5F)。在两种葡萄糖浓度下,将葡萄糖水平从25mM降低至5mM降低了H3K18la,但TGF-β1增加了H3K18la,同时降低了H3K18ac(图S5G)。和预期相符,α-SMA基因的表达和COL1A1基因表达均由TGF-β1诱导(图S5H)。研究人员随后的研究揭示了在TGF-β1处理后的较晚时间点(6-24h)H3K18la持续增加,这与诱导HSC活化的基因显著上调相关(图S5I和S5J)。相比之下,H3K18ac水平在1h时略微增加,但在TGF-β1处理后,这种增加随后连续降低(图S5I)。为了确定TGF-β1对Lx-2细胞中α-SMA基因启动子的组蛋白修饰的影响,研究人员进行了ChIP-qPCR以分析启动子区域的组蛋白乳酸化和乙酰化。与研究人员的免疫印迹结果一致,TGF-β1增加了α-SMA启动子上的H3K18la但降低了H3K18ac(图S5K)。接下来,研究人员发现草酸盐和DCA减少H3K18la并抑制由TGF-β1升高的α-SMA表达(图S5L、S5N、S5Q和S5S)。研究人员进一步证实了这种抑制不是由于细胞死亡(图S5M和S5R)。在研究人员的挽救实验中,通过乳酸处理恢复了诱导活化基因的表达降低(图S50、S5P、S5T和S5U)。研究人员的结果表明,干扰乳酸产生减少H3K18la和诱导HSC激活相关基因的表达,这可以通过添加乳酸而恢复。总之,这些结果表明,组蛋白乳酸化在HSC激活和随后的基因表达诱导中起关键作用。

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图6 HK2基因特异性缺失对CCl4诱导的肝纤维化的影响

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辅图6 乳酸给药可恢复HSC特异性HK2缺失小鼠肝脏的纤维化

7.HDAC抑制剂升高H3K18ac但抑制H3K18la,从而抑制诱导HSC激活的基因表达

组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)催化从组蛋白赖氨酸残基去除乙酰基,导致染色质收缩抑制基因转录。先前的研究表明,抑制仅位于细胞核中的I类HDAC可在体外和体内失活HSC。研究人员发现H3K18la是反映HSC活化诱导基因表达的新型组蛋白修饰,他们假设I类HDAC抑制剂可能诱导H3K18ac,其与H3K18la竞争组蛋白H3上的相同赖氨酸18残基。首先,研究人员用I类HDAC抑制剂apicidin和MS275(恩替司他)处理活化的小鼠原代HSC(图5I)。抑制剂处理增加了H3K18ac但降低了H3K18la,表明K18上乙酰化和乳酸化之间存在竞争(图5J)。接下来,apicidin和MS275处理显著降低了基因表达和增殖,并且这些作用不是由于细胞死亡(图5K、S5V和S5W)。为了进一步探讨组蛋白乳酸化和乙酰化之间竞争的可能性,研究人员用乳酸和乙酸盐处理Lx-2细胞。单独的乳酸盐处理增加α-SMA表达,但单独的乙酸盐处理显示相反的效果(图S5X和S5Y)。值得注意的是,当添加乙酸盐时,乳酸诱导的α-SMA表达被消除(图S5Z)。事实上,H3K18la通过乳酸处理高度升高,但再添加乙酸盐时,这种效果被抑制,从而恢复了H3K18ac水平(图S5A)。因此,研究表明,I类HDAC抑制剂可以通过上调H3K18ac来失活HSC,导致H3K18la依赖性基因表达的下调。

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图7 全身缺失HK2抑制CCl4和BDL诱导的肝纤维化

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辅图7 全身缺失HK2对肝纤维化的影响

8.HSC特异性和全身性缺失HK2抑制小鼠肝纤维化

为了进一步证实HK2/H3K18la在肝纤维化背景下HSC中的作用,研究人员首先使用了HK2f/f;LratCre小鼠,其中HK2可以在HSC中特异性缺失。将小鼠注射CCl4 3周以诱导肝纤维化(图6A)。天狼星红和Masson三色染色显示,当在HSC中缺失HK2时,由CCl4引起的胶原蛋白的积累在肝脏中显著减少(图6B和6E)。与胶原沉积类似,在HSC特异性HK2-KO小鼠肝脏中α-SMA表达显著降低(图6B和6D)。为了验证H3K18la水平是否反映体内HSC激活,研究人员分离CCl4诱导后后的HK2f/f和HSC特异性HK2-KO小鼠肝原代HSC。结果表明,HK2缺乏可以显著降低小鼠肝原代HSC中H3K18la水平(图6C)。然而,H3K18ac水平没有改变。血清ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的结果显示HSC中的HK2缺失不影响肝脏毒性(图6F)。考虑到体外实验中外源补充乳酸挽救了HSC中HK2缺失的导致HSC失活的表型,研究人员接下来在持续三周的CCl4注射时通过腹腔注射2g/kg乳酸,评估乳酸在HSC特异性HK2-KO小鼠中的作用(图S6A)。有趣的是,天狼星红和α-SMA免疫染色结果显示,通过在体内添加乳酸,HSC特异性HK2-KO小鼠肝脏中减少的胶原沉积和α-SMA表达得以恢复(图S6B和S6C)。总之,研究人员的发现表明HSC特异性缺失HK2减轻HSC中的H3K18la并抑制肝纤维化,而体内慢性和全身性乳酸治疗恢复胶原沉积和α-SMA表达。

研究人员先前已经证明,成年小鼠中的全身性HK2缺失是良好耐受的,并且对于乳腺癌和肺癌是治疗性的,而没有不利的生理后果。为了证明HK2是肝纤维化的治疗靶点,研究人员通过使用HK2f/f;UBCCreERT2小鼠,其具有普遍表达的他莫昔芬诱导型Cre重组酶。HK2f/f;UBCCreERT2小鼠在6-7周龄时用他莫昔芬处理,并且在表达HK2的成体组织中证实了有效的HK2下降(图S7A和S7B)。在研究人员的单剂量CCl4造模实验中,研究人员观察到第3区(小叶中心)肝细胞在HK2正常小鼠和全身性HK2缺陷小鼠中类似地受损(图S7C和S7F)。然而,在具有全身性HK2缺失的小鼠的肝脏中,α-SMA的表达被显著抑制(图S7C-S7E)。研究人员接下来用CCl4处理全身性HK2缺失的小鼠3周(图7A)。值得注意的是,研究人员的天狼星红和Masson三色染色结果表明,在HK2全身性缺失后,肝脏中的胶原积累被显著抑制(图7B和7D)。此外,α-SMA表达的也显著降低(图7B和7C)。为了进一步分析全身性HK2缺失的抗纤维化作用,研究人员接下来在HK2f/f;UBCCreERT2小鼠注射他莫昔芬后建立BDL诱导的纤维化模型(图7F)。与研究人员在先前体内实验中的发现一致,全身性HK2缺失有效地抑制了BDL小鼠肝脏中的胶原积累和α-SMA的表达(图7G-7I)。在CCl4诱导和BDL诱导的纤维化模型中,血清ALT和AST活性在HK2正常组和HK2缺失组之间相似,表明体内全身性HK2缺失不会引起显著的细胞毒性(图7E和7J)。接下来,为了进一步了解全身性HK2缺失在治疗中的作用,研究人员首先通过CCl4诱导肝纤维化3周,然后全身性缺失HK2(图7K)。在全身HK2缺失的小鼠肝脏中,天狼星红和Masson三色染色显示胶原沉积显著减少(图7L和7M)。研究人员观察到,当建立肝纤维化后HK2全身缺失时,α-SMA表达也减少(图7N)。此外,当在诱导肝纤维化之后缺失HK2时,血清ALT和AST活性没有显著影响(图7O)。最后,在用CCl4处理3周的对照UBCCreERT2小鼠的实验中,天狼星红阳性区域和α-SMA表达不受他莫昔芬的影响(图S7G-S7J),这表明全身性HK2缺失后HSC活化的降低不是Cre活性的副作用。总之,研究人员的结果显示靶向HK2全身性抑制HSC活化。因此,HK2可能是肝纤维化的治疗靶点。

总结

本研究揭示了HK2介导的乳酸产生通过组蛋白乳酸化影响基因表达,证实在活化的HSC中诱导HK2的表达对于HSC的激活至关重要,并且由HK2表达引起的组蛋白乳酸化决定了HSC激活后的基因表达。HSC通过基因缺失HK2或药理学抑制乳酸产生,减少组蛋白乳酸化,抑制HSC的激活。此外,本文还发现组蛋白乳酸化与组蛋白乙酰化竞争。值得注意的是,研究人员通过CUT&Tag实验在小鼠原代HSC中发现了H3K18la和H3K18ac的全基因组分布,并且揭示了小鼠HSC特异性HK2缺失或HK2的全身性缺失减轻了HSC活化和肝纤维化。这些结果表明,靶向HK2/H3K18la的表达可能是肝纤维化的潜在治疗策略。

原文链接https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413123002231?via%3Dihub

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