代谢学人
Cell：线粒体还原应激“守门员”
撰文| 陈江榕 马莹 张俊 武霞 郭明伟 编辑| 孟美瑶 校对| 张俊
背景介绍
多细胞动物成年后所需的200多种细胞类型的发育依赖于体内精细平衡的转录网络。干细胞处于这一复杂程序的顶端，其稳态失调会导致许多发生于胎儿发育或幼儿期的早发性疾病，如特纳和唐氏综合症。此外，多能干细胞也能够支持组织修复，因此它们修复功能的异常与肿瘤发生和组织变性相关。
为了保护干细胞群免受损伤，生物具有保守的应激反应途径，可以检测并缓解广泛的不利条件。许多干细胞存在于缺氧环境中，并依赖糖酵解作为主要的能量来源，这限制了DNA、脂质或蛋白质的氧化损伤程度。如果过多的活性氧(ROS)积累，这些细胞会稳定转录核因子E2相关因子2 (NRF2)来激活氧化应激反应。NRF2驱动具有清除氧化分子功能的蛋白质表达，并将氧化的蛋白恢复到其有功能的还原状态。抗氧化信号激活失败会损伤干细胞的自我更新和分化，以及组织的自我维持功能。此外，应对蛋白质错误折叠、DNA损伤或缺氧环境时，激活应激反应也能保护干细胞的完整性。
与它们的快速激活相对应，应激反应必须在细胞内稳态恢复后很快关闭。不能关闭氧化应激反应的干细胞无法积累信号传导所需的ROS，并且无法分化。机体处于持续缺乏ROS或还原性应激状态也会阻碍胰岛素信号传导和葡萄糖稳态，并减弱运动对胰岛素敏感性的积极作用，随后诱发心肌病、肥胖或糖尿病，并增加死亡率。总之，细胞长期处于还原应激状态会导致众多严重后果，因此亟需探究细胞感知并缓解还原应激的机制。
应激反应通常由泛素化控制，这种修饰的特异性是由数百个E3连接酶赋予的。Kelch 样ECH 关联蛋白1 (KEAP1)与Cullin-3 (CUL3)和RBX1配对形成E3 CUL3KEAP1复合物，该蛋白可将NRF2隔离并泛素化。当细胞经历氧化应激时，CUL3KEAP1受到抑制，NRF2在细胞核内积累，驱动抗氧化基因表达。肿瘤抑制蛋白VHL也能够与Cullin-3和RBX1配对形成E3 CUL2VHL复合物，进而抑制HIF-1a的功能，直到缺氧应激使该转录因子稳定表达，从而启动血管生成。VHL或KEAP1的缺失分别导致胚胎期或出生后早期死亡，这凸显了准确的应激信号传递的重要性，并且它们的突变是癌症的常见原因。还原应激是否也受泛素依赖性应激反应的控制，以及其对发育的重要性还尚未研究。
本篇文章中，研究人员利用成肌细胞分化的氧化还原敏感通路鉴定了CUL2FEM1B和它的靶蛋白卵泡蛋白相互作用蛋白1 (FNIP1)是还原性应激反应的核心成分。线粒体失活而无法积累信号传导所需的ROS或其他抗氧化信号会逆转FNIP1中保守Cys残基（小编注：即FNIP1同源蛋白质序列中都含有的保守残基）的氧化状态，即还原Cys中的二硫键，而FNIP1是CUL2FEM1B与底物结合的先决条件（小编注：首先，FNIP1降解子中的三个Cys以及相邻的His残基都是FEM1B结合和蛋白酶体降解所必需的，其次，进一步研究发现CUL2FEM1B仅结合处于还原状态的FNIP1，不结合氧化型蛋白）。随后FNIP1的泛素化和蛋白酶体降解增加线粒体输出，产生ROS，并保持氧化还原稳态。因此，还原应激反应是建立在泛素依赖性调节基础上的，其根据细胞需求调节线粒体输出，并将脊椎动物的应激和发育信号结合起来。
敲黑板啦！
1. 缺乏活性氧（ROS）或氧化应激减少抑制肌生成；
2. 还原应激可以逆转FNIP1中保守Cys残基的氧化；
3. 只有还原型FNIP1才会被CUL2FEM1B多聚泛素化；
4. FNIP1降解导致线粒体激活以重新校准ROS。
研究结果
1 还原应激抑制成肌细胞分化
作为一种依赖氧消耗的组织，肌肉是研究氧化还原应激中调节蛋白的重要组织。首先，研究人员联想到Cullin-Ring-E3连接酶（CRLs，一个已知控制应激和发育信号传导的E3蛋白家族）是否在体外的肌肉生成中是必需的。他们分别从C2C12成肌细胞中通过siRNA敲减7种Cullin蛋白表达，并通过肌球蛋白重链（MyHC）染色观察肌管形成。结果表明，CUL2和CUL3对肌管形成尤为重要（拓展图1A），这与前人研究中的CUL3敲除对小鼠肌肉发育的影响是一致的。
CUL2和CUL3通过包含VHL盒或BTB结构域的接头蛋白选择它们的底物。结合质谱以及CUL2和CUL3亲和纯化技术，研究人员在成肌细胞或肌管中检测到19个CUL2和32个CUL3接头，其中包含一些潜在的接头蛋白，如肌肉萎缩症蛋白质myoferlin和家族性肌病相关的因子KLHL9。将这一列表与来自其他细胞类型的接头蛋白结合后，他们从成肌细胞中敲减156个CRL2和CRL3亚基（小编注：CRL（Cullin-RING ligase）E3泛素连接酶是细胞内最大的多亚基泛素连接酶家族，由Cullin蛋白（CUL）、RING-finger蛋白（RBX1/RBX2）、接头蛋白及底物识别蛋白组成。作者通过质谱和亲和层析在成肌细胞和肌管中筛选出了一些CUL2和CUL3的底物接头蛋白，随后将这些蛋白结合另外三篇文献中，在293T等其他细胞系中筛选的CUL2和CUL3接头蛋白，共同得到156个CRL蛋白组分。因为其中包含了CUL2和CUL3，故通过上一级专有名词指代。简单而言，CRL2/3亚基包含了CUL2/3和它在多种细胞系中的底物接头蛋白），随后对细胞开始分化，并通过显微镜检查和自动图像分析记录MyHC阳性肌管（图1A）。
筛选结果显示，CUL3的接头蛋白KEAP1、BTBD9、KLHL22和ANKFY1是肌管形成所必需的，而CUL2的接头蛋白fem1同源物B（FEM1B）的敲减极大地促进了肌管分化（图1A-1C）。由于这些接头缺失对细胞数量的影响很小（拓展图1B），因此异常细胞分裂或存活不太可能是细胞命运特征发生变化的原因。然而，文献表明所有肌管形成所需的接头蛋白都与疾病有联系：KEAP1的突变导致肺和肾癌，BTBD9突变触发不宁腿综合症和失眠，KLHL22过表达推进乳腺癌发展，ANKFY1的突变导致激素耐药型肾病综合征。
研究人员发现，氧化应激传感器KEAP1的敲减抑制了成肌细胞的分化。KEAP1的遗传敲除会使NRF2长期稳定表达，并引发还原应激（小编注：还原应激的现象包含ROS减少，以及NADH、NADPH和GSH等还原当量上升）。成肌细胞中的KEAP1敲减诱导NRF2（图1C和1D）及其靶基因（图2E和2F）的积累，这导致NADPH水平增加（拓展图1C）和氧化型应激标志物ROS急剧下降（小编注：作者在图1E中标注的为H2O2，但是原文却写成“a steep drop in ROS, the hallmark of reductive stress”，并且后文对这张图的解释也同样是ROS。因此我们认为可能是作者标注有误，已更改原文）（图1E）。当研究人员通过siRNA敲减NRF2或谷胱甘肽合成/再循环酶来减弱这种抗氧化信号时，可以恢复成肌细胞分化。（图1D和图1F;拓展图1D）。线粒体源性ROS的清除剂（小编注：作者在C2C12分化期间添加ROS清除剂S1QEL1.1和S3QEL 2，这两种小分子药物能够通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ产生ROS，进一步施加还原压力）也抑制了成肌细胞分化（图1G）。因此可以得出结论，还原应激会在体外损害肌生成，与文献中使用KEAP1抑制剂通过Nrf2介导成肌细胞分化抑制的结果一致。虽然这支持了ROS发挥关键信号作用的观点，但也带来了以下问题：在正常发育过程中，还原应激是如何被感知和抵消的。
图1 还原应激抑制肌管形成
拓展图1 CRL2和CRL3 E3连接酶是成肌细胞分化所必需的
2 FEM1B与KEAP1功能拮抗
为了分析细胞对还原应激的反应，研究人员设计了一种基因筛选方法，旨在改善KEAP1缺陷的成肌细胞分化。研究人员将E3连接酶作为可能的应激调节因子。FEM1B已经在前文提到过的初始筛选中出现，FEM1B敲减与KEAP1敲减的表型相反，且相比于其他接头蛋白，FEM1B敲减对肌管形成的促进作用最强（图1A）。因此，作者将siKEAP1和siFEM1B同时添加到成肌细胞分化的过程中，并在显微镜下观察，发现尽管缺乏KEAP1，但CUL2接头FEM1B的敲减能促进肌管形成（图2A和图2B）,随后通过肌管分化因子MYOG和MyHC的WB实验也证实了这一结果（图2B和图2C）。在线粒体来源的ROS清除剂存在的情况下，FEM1B的敲减也能改善分化，这表明FEM1B会影响通过外源方式施加的还原应激（图2D）。
基因表达分析表明，KEAP1敲减诱导抗氧化剂NRF2靶基因表达，如谷胱甘肽合成酶、ROS清除剂或戊糖磷酸途径的组分（图2E和2F；拓展图2A和S2B）。敲减FEM1B产生相反的作用，减少NRF2靶基因表达，但增加了肌生成标志物MYOG和MYL1 表达（图2E和图2F）。重要的是，KEAP1和FEM1B的同时敲减（siKEAP1/siFEM1B）减弱了单个E3连接酶（siKEAP1或siFEM1B）敲减的表型（图2E和图2F;拓展图2A）。与这些结果一致，在KEAP1敲减的成肌细胞中，敲减FEM1B可恢复ROS水平（图1E）。
虽然KEAP1主要以控制NRF2水平的功能为人所知，它也能将转录因子隔离在细胞质中（小编注：NRF2含有一高度保守的亮氨酸拉链（basic region-leucine zipper，bZIP）结构，根据Nrf2 的保守序列可分为6个功能结构域，即Neh1-Neh6 (Nrf2-ECH homology)。Neh2分子通过两个结合位点与KEAP1相互作用，即结合较强的ETGE基序和结合较弱的DLG基序，使得NRF2能够稳定存在于细胞质中。在正常生理条件下，NRF2和KEAP1结合，被其锚定在细胞质中，处于未激活状态。而KEAP1与CUL3形成泛素E3连接酶复合物，能够促使NRF2发生泛素化且被蛋白酶体快速降解。因此，在非应激条件下，NRF2被合成，也不断被降解，所以表达量非常低）。尽管FEM1B敲减降低了NRF2的mRNA表达水平（拓展图2C），但它对NRF2蛋白的丰度只有轻微影响（图2C）。相反，FEM1B的敲减对NRF2的定位有显著影响；尽管NRF2在KEAP1缺陷的成肌细胞的细胞核中积累，但共敲减FEM1B将NRF2定向到核周区域，因此不能诱导基因表达（图2G）。因此，研究人员的实验结果确定了FEM1B是氧化还原信号的关键调节因子，并提出E3 CUL2FEM1B可能直接或间接影响还原应激。
图 2 在还原应激条件下，FEM1B的敲减仍能使成肌细胞分化
拓展图 2 验证FNIP1是CUL2FEM1B特定的底物
3 CUL2FEM1B靶向蛋白酶体降解FNIP1
之前的研究表明，在CUL2的接头蛋白的VHL盒中有一个Leu残基，该残基与伸长素C（Elongin C）上的一个口袋相连，从而将CUL2的接头蛋白。连接到由CUL2、Elongin B和RBX1组成的复合体上。同时，FEM1B残基Leu597的突变导致其无法与CUL2结合，故不能支持泛素化（拓展图2D），但其包含锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats），因此保留了其识别底物的能力。与其他CRLs一样，研究人员预测FEM1BL597A能只与靶点结合而不介导其泛素化降解，从而有助于CompPASS质谱法对其进行鉴定。
蛋白质组学分析证实，FEM1BL597A与CUL2、Elongin B和Elongin C的结合能力受损（图3A）。相比于FEM1B，FEM1BL597A与一些底物蛋白的结合能力更强，其中包括GATOR1复合物（在氨基酸限制期间抑制mTORC1信号传导），以及卵泡素（FLCN）和FNIP1，但并未检测到FNIP1的同源基因FNIP2。研究人员通过免疫沉淀反应和WB证实，FEM1B与GATOR1、FLCN和FNIP1通过FEM1B中VHL盒的突变来稳定结合（图3B;拓展图2E）。相反，底物结合锚蛋白重复序列中的保守残基Cys186的突变显著降低了FEM1B对GATOR1、FLCN和FNIP1的识别效率（图3B）。
FEM1B过表达引发CUL2和蛋白酶体依赖的FNIP1降解，而底物结合缺陷的FEM1BC186S、失活的FEM1BL597A或相关接头蛋白FEM1A没有这一效果（图3C;拓展图2E和S2F）。FEM1B敲减导致了相反的结果，即内源性FNIP1水平增加（图3D）。NEDD8修饰的CUL2FEM1B在体外与E2酶UBE2D3和UBE2R1共孵育时也能使FNIP1多泛素化（图3E）。相比之下，FEM1B的表达不会诱导FLCN、GATOR1亚基或FNIP2的降解（图3B;拓展图2E-S2G），CUL2FEM1B在体外也未能将这些蛋白泛素化（图3E;拓展图2H）。因此可以得出结论，FNIP1是CUL2FEM1B蛋白水解的底物，而FLCN或GATOR1可能间接地与FEM1B相互作用，或者发挥与降解靶标不同的作用。
虽然 FNIP1 的敲减对分化几乎没有影响（扩展图 2I），但 FNIP1与FEM1B的共同敲减可以恢复 FEM1B 敲减对肌管形成的影响（图3F，扩展图2I、2J）。因此，在缺乏FEM1B的情况下，FNIP1的积累促进了分化。在同时敲减FEM1B和KEAP1的细胞中，敲减FNIP1也会抑制肌生成过程（图3G），并且可以促使NRF2重新进入细胞核中（图3H），这就表明了正是FNIP1的稳定表达，促使成肌细胞绕过还原应激。
研究人员认为，FNIP1是CUL2FEM1B在还原应激过程中的关键靶点。之前的研究表明FNIP1与线粒体生物发生、受损线粒体的清除以及AMPK和mTORC1激酶的调节有关。虽然已在肾癌中检测到体细胞FNIP1变异，但Birt-Hogg-Dube综合征（一种由异常线粒体活性或VHL、KEAP1或NFE2L2突变引起的肾癌易感性）则是由其伴侣FLCN突变导致的。
图3 FNIP1是还原应激过程中CUL2FEM1B的关键底物
4 FEM1B识别FNIP1中一个保守的Cys降解子
为了确定ROS是否调节CUL2FEM1B对FNIP1的识别，研究人员首先需要确定与FEM1B结合的FNIP1 降解子（degron，蛋白降解子是蛋白上包含的一段特定氨基酸序列，可被细胞内的蛋白酶识别，以介导蛋白的降解清除）。通过蛋白截断实验，研究人员在FNIP1的中央区域发现了一小段片段，该片段被CUL2FEM1B识别并被蛋白酶体降解（图4A和4B）。于是作者将GFP与FNIP1降解子融合表达（GFPdegron），故可以便利地将CUL2FEM1B检测出来（小编注：文中将FLAGFEM1B或FLAGFEM1BL597A与GFP或GFPdegron (GFP-FNIP1562-591)共转染293T细胞。对FLAGFEM1B变异体进行亲和纯化，然后用WB检测结合的GFP。由于FEM1BL597A与CUL2、Elongin B和Elongin C的结合能力受损，所以导致E3连接酶复合物难以结合接头蛋白FEM1B，进而调控底物泛素化降解，但却不影响FEM1B与底物蛋白FNIP1的结合（前文提到相比于FEM1B，FEM1BL597A能更强地结合底物蛋白），所以可以检测出来）（拓展图3A和S3B）。与全长FNIP1一样，GFPdegron与底物类似物FEM1BL597A的结合较强（拓展图3A），但与FEM1BC186S无相互作用（拓展图3B）。接下来，研究人员将GFPdegron与mCherry一起表达，并使用GFP/mCherry比值作为蛋白质降解的定量读数，结果只有FEM1B显著降低了GFPdegron的含量（图4C）。此外，研究人员通过CRISPR-Cas9敲除FEM1B、利用shRNA敲减FEM1B或抑制E3蛋白酶活性后发现，这些方法都可以防止GFPdegron降解（图4D;拓展图3C和S3D）。FNIP1降解子还介导了与重组FEM1B之间较强相互作用，以及CUL2FEM1B的泛素化（图4E和4F）。因此，FNIP1通过CUL2FEM1B泛素化和降解需要一个中心降解子。虽然这个降解子在FNIP1同源物中是保守的（拓展图3E），但CUL2FEM1B不能识别其同源物FNIP2（小编注：如拓展图3F所示，这个降解子只是在不同物种的FNIP1中保守，但是FNIP1和FNIP2的序列是不一样的，FNIP1 degron在FNIP2中不保守）（拓展图3F）。
考虑到CUL2FEM1B在还原应激信号传导中的作用，研究人员发现FNIP1降解子含有三个不变的Cys残基（拓展图3E）。Cys585对于FEM1B依赖的GFPdegron降解至关重要（图5A）。Cys580和Cys582的同时突变严重抑制了GFPdegron的清除，所有Cys残基的突变充分保护了GFPdegron免受CUL2FEM1B依赖的降解（图5A）。突变其Cys残基阻断了降解子与重组FEM1B的结合（图5B），并阻止其被CUL2FEM1B泛素化（图5C）。在全长FNIP1中，对Cys残基的依赖更加明显，其中三个Cys以及相邻的His残基都是FEM1B结合和蛋白酶体降解所必需的（图5D;拓展图4A）。
根据这一突变分析，研究人员用修饰Cys的碘乙酰胺或N -乙基马来酰亚胺处理FNIP1降解子抑制了FEM1B对其的识别（图5E;拓展图4B和S4C）及其依赖于CUL2FEM1B的泛素化（图5F）。研究人员在细胞中也观察到类似的结果，其中碘乙酰胺衍生物IA-Alkyne破坏了FEM1B依赖的GFPdegron降解（图5G）。由此可以得出结论，还原应激中E3连接酶CUL2FEM1B依赖于未修饰的Cys降解子来识别其基本底物FNIP1。
图 4 FEM1B结合FNIP1中的一个保守降解子
图 5 FNIP1降解子的功能需要Cys残基
拓展图 3 FNIP1含有与CUL2FEM1B识别的保守降解子
拓展图 4 Cys残基对FNIP1降解子功能至关重要
5 还原应激触发CUL2FEM1B对FNIP1的识别
考虑到Cys残基在CUL2FEM1B识别中的作用，研究人员接下来确定了在正常条件和还原应激下FNIP1降解子的氧化状态。尽管用多种蛋白酶甚至合成肽处理FNIP1免疫沉淀物，研究人员仍无法通过蛋白质组学方法检测整个降解子。这一降解子也没有出现在Cys氧化的整体分析中，这表明质谱分析无法检测到该降解子。这可能是因为FNIP1中另外30个Cys残基阻碍了选择性衍生化（在质谱中，衍生化主要通过结合具有永久电荷的基团来改善电离特性，特别是对于不能有效被电离的分析物，如醛、糖和类固醇）。然而，由于降解子容易形成二硫键（拓展图5A），研究人员选择使用硫氧还蛋白TRX分析其氧化情况。TRX含有一个Cys残基活性位点，可攻击细胞内的二硫键，然后第二个TRX Cys会靶向混合二硫化物，并释放还原性蛋白质。缺少第二个Cys的TRXC35S突变体不能分解混合二硫化物和共价捕获氧化蛋白，因此蛋白质被TRXC35S捕获的越多，在细胞中被氧化的程度就越高。
研究人员发现，在正常条件下GFPdegron被TRXC35S有效捕获，而不含Cys的报告基因则没有被TRXC35S有效捕获（图6A），表明在正常条件下，降解子处于高氧化状态。此外，研究人员发现a -酮戊二酸（通过增加线粒体TCA循环的通量来增加ROS）或抗霉素A（通过抑制线粒体复合物III来增加ROS）均增强了TRXC35S对GFPdegron或全长FNIP1的捕获（图6B;拓展图5B）。重要的是，CUL3KEAP1抑制后的ROS耗尽保护了降解子免受TRXC35S的影响，这证明了还原应激期间降解子氧化的逆转（图6C）。
根据前文的结论，降解子的氧化状态能控制CUL2FEM1B对FNIP1的识别。即使在没有还原剂的情况下短暂孵育降解子（小编注：研究人员用一种结合缓冲液孵育降解子的，这个缓冲液由40mM HEPES 7.5，150mM NaCl和0.2%NP40组成，然后研究人员在这个缓冲液中加入了还原剂TCEP或者氧化剂去孵育降解子CUL2FEM1B）也会破坏其与FEM1B的结合，而Tris（2-羧乙基）盐酸膦 （TCEP）可以恢复这种结合（图6D）。对细胞处理α-酮戊二酸治疗或抗霉素A处理可以依赖于呼吸链产生的ROS防止GFPdegron降解（图6e和6f;拓展图5C）。类似的是，粘噻唑（Myxothiazol）也可以通过增加ROS防止GFPdegron降解（拓展图5D和S5E），以及抗氧化酶GSR和TXRND1的敲减 （拓展图5F）也获得了类似观察结果。相反，引起还原应激的条件，如谷氨酰胺饥饿或CUL3KEAP1抑制导致的线粒体失活，会加速GFPdegron的降解（图6F;拓展图5G）。
将这些结果扩展到全长蛋白，抗霉素A减少了FNIP1与FEM1B的结合，但还原应激强烈促进了这种相互作用（图6G）。事实上，当FEM1B和FNIP1以内源性水平存在时，只有在抑制CUL3KEAP1而施加还原应激后，研究人员才能检测到它们之间的关联（图6H）。研究人员对293T细胞处理KEAP1的抑制剂来模拟还原应激后发现，还原应激也降低了FNIP1的蛋白质水平，但增加了内源性FNIP1的泛素化（图6I）。由此可以得出结论，还原应激逆转了FNIP1降解子中Cys残基的氧化，并允许CUL2FEM1B结合FNIP1并使其降解。这些发现确定FNIP1降解子是CUL2FEM1B的还原应激传感器。
图 6 FNIP1降解子对氧化还原敏感
拓展图 5 FEM1B识别未修饰的FNIP1 降解子
6 FNIP1降解控制线粒体功能
研究人员推测FNIP1降解可能调节AMPK或mTORC1的活性，因为这些激酶控制线粒体的生物发生，而线粒体产生大多数细胞ROS。然而，尽管FEM1B敲减略微改善了成肌细胞中氨基酸依赖的mTORC1激活，但FEM1B和FNIP1共敲减增强了这一激活效应（拓展图6A）。FEM1B敲减小幅度增加了AMPK活性，这一效应也不受FNIP1共敲减的影响（拓展图6B）。此外，其降解子突变不影响FNIP1与AMPK或mTORC1调节因子的结合（拓展图6C），这表明FNIP1的稳定性不影响成肌细胞中mTORC1或AMPK信号传导。
另外，FNIP1的稳定性可能直接影响线粒体。事实上，尽管FEM1B敲减并未减少线粒体含量（拓展图6D），但透射电镜下，FEM1B敲减细胞的所有线粒体均显示重度染色的基质（图7Ab）。因此，在FEM1B敲减的细胞中，线粒体发生基质浓缩，这是由于缺乏氧化磷酸化的底物造成的（小编注：图7A是线粒体透射电镜示意图，他们四氧化锇固定了样品，四氧化锇是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白,使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。由图7B可知，FEM1B的敲减降低了线粒体膜电位，而线粒体膜电位的降低会导致线粒体基质浓缩，线粒体膜电位的降低涉及的机制有氧化磷酸化底物的缺乏、呼吸链阻断和线粒体内膜的解耦连）。许多线粒体的嵴表现出洋葱式状的旋转（图7 Ac），表明受损的氧化磷酸化反应导致呼吸链成分上调（小编注：因为洋葱状旋转线粒体嵴就会增加线粒体内膜的面积，而线粒体呼吸链的组分位于线粒体内膜上，所以洋葱状的嵴就会增加内膜上与呼吸链相关的组分，如细胞色素c、ATP合成酶等），一些线粒体含有大量在线粒体自噬开始时观察到的囊泡（图7Ad）（小编注：前文作者发现敲减FEM1B会导致线粒体表现出基质浓缩和洋葱式的旋转嵴，进一步导致ROS显著上升，生成的ROS一方面能作为信号分子促进成肌细胞的分化，另一方面又会导致线粒体出现氧化损伤。这里作者在极端情况下探究了ROS含量过高的影响，但是正常生理状态下，ROS水平一般处于既能促进分化又不会对线粒体造成损伤的范围内）。这些表型被FEM1B和FNIP1共敲减修复（图7Af），表明FNIP1的稳定改变了线粒体形态，并且该形态改变与氧化磷酸化减少导致的形态变化相反。
与这些发现一致，FEM1B敲减降低了线粒体膜电位，而FNIP1敲减增加了线粒体膜电位（图7B）。敲减FEM1B的细胞还出现了围绕在细胞核周围的碎片化线粒体（图7C），并且不产生线粒体ROS（图7D）。FNIP1敲减改善了这些表型（图7B-7D），表明FNIP1的存在抑制了线粒体产生ROS，抵消了还原应激，但FNIP1被CUL2FEM1B降解后，增加了线粒体输出ROS。
图 7 证明FNIP1的降解起到线粒体守门人的作用
拓展图6 FEM1B和FNIP1控制代谢
7 FEM1B和FNIP1是代谢调节因子
接下来，作者开始探究细胞质FNIP1降解如何改善线粒体活性。线粒体含有脂肪酸β-氧化和三羧酸循环的酶，这些酶将乙酰辅酶A（CoA）转化为氧化磷酸化和氨基酸合成的底物。为了促进这些反应，线粒体输入丙酮酸、脂肪酸或TCA循环中间体，并偶联细胞质代谢与线粒体能量产生。
研究人员想确定FNIP1的稳定性是否影响丙酮酸的主要来源——糖酵解。根据耗氧量监测结果显示，FEM1B敲减降低了成肌细胞的糖酵解率，而呼吸链本身未受影响（拓展图7A和S7B）。反映丙酮酸下游乳酸分泌情况的细胞外酸化率也因FEM1B的敲减而降低（拓展图7C）。液相色谱偶联质谱分析表明，FEM1B的敲减消耗了细胞中的糖酵解和TCA循环中间体（图7E;拓展图7D）。此外，敲减FEM1B使得葡萄糖水平（图7 E）以及葡萄糖摄入降低 （拓展图7E）。然而，在FEM1B和FNIP1共敲减后，只有少数糖酵解中间产物增加，葡萄糖摄入仅轻度改善（拓展图7E）。质谱实验表明，成肌细胞从葡萄糖获得的TCA循环中间产物很少（拓展图7F），而且葡萄糖碳原子到TCA循环的通量不受FEM1B敲减的影响（拓展图7G）。在还原应激期间，葡萄糖利用酶的共同敲减也不能恢复分化（拓展图7H）。因此，尽管FEM1B影响葡萄糖代谢，但这可能涉及与不同FNIP1的底物。
成肌细胞从谷氨酰胺获得大多数TCA循环中间产物（拓展图7F），谷氨酰胺在进入线粒体之前被转化为谷氨酸。代谢组学分析发现，FEM1B敲减降低了谷氨酸水平，而FNIP1的敲减则会增加其丰度（图7E）。同时敲减FEM1B和FNIP1可消除上述表型。类似地，其他线粒体穿梭的成分在FNIP1敲减时增加，在FEM1B敲减时减少，而在FEM1B和FNIP1敲减的成肌细胞中没有变化，这些代谢物包括瓜氨酸和鸟氨、脂肪酸载体乙酰肉碱及其前体泛酸酯、NADH穿梭甘油-3-磷酸（图7E）。因此，通过CUL2FEM1B降解FNIP1增加了几种代谢物穿梭的可用性，这可能为启动TCA循环和诱导线粒体来源的ROS产生提供了一种手段，生成的一定水平的ROS能够作为信号分子在干细胞中发挥促进分化的功能，然而ROS的具体分子靶标仍未阐明。一些研究表明ROS通过调节硫氧还蛋白家族成员核氧还蛋白的氧化还原状态，进一步促进β-连环蛋白的稳定性，从而激活Wnt信号通路。此外，ROS还是干细胞中PTEN活性的重要调节因子，PTEN进一步调节Wnt信号。总之，CUL2FEM1B和FNIP1不仅感知并缓解还原应激，并且这些蛋白是还原应激反应的核心模块。
拓展图 7 FNIP1和FEM1B控制大量的线粒体代谢产物和穿梭物
总结
多细胞动物依靠保守的应激反应途径来应对不良环境并保存细胞完整性。应激反应在为组织形成和修复提供终身支持的干细胞中尤为重要，但这些保护系统如何整合到发育过程中尚不清楚。在这里，研究人员使用成肌细胞分化来证明E3连接酶CUL2FEM1B及其底物FNIP1是还原性应激反应的核心成分。由长时间的抗氧化信号传导或线粒体失活引起的还原性应激，可以逆转FNIP1中保守Cys残基的氧化，使得CUL2FEM1B能够识别其靶标FNIP1，并使其泛素化，进而激活线粒体以抵消还原应激。随后，蛋白酶体降解FNIP1，并增加细胞内多种代谢物的可用性，诱导线粒体三羧酸循环启动并在氧化呼吸过程中产生ROS。一定水平的ROS可能通过Wnt和Notch信号通路，调节肌肉干细胞的增殖和分化，最终保持氧化还原稳态和干细胞功能的完整性，但ROS的分子靶标仍需进一步的研究。总之，还原应激反应是建立在泛素依赖性调节的基础上的，其根据氧化还原的需要调节线粒体活性，并涉及在协调应激和发育信号传导方面的代谢控制。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286742031076X
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