徐凌燕
Cell:线粒体还原应激“守门员”
2023-10-16 09:31
阅读:1459

代谢学人

Cell:线粒体还原应激“守门员”


撰文| 陈江榕 马莹 张俊 武霞 郭明伟 编辑| 孟美瑶 校对| 张俊

image.png


背景介绍


多细胞动物成年后所需的200多种细胞类型的发育依赖于体内精细平衡的转录网络。干细胞处于这一复杂程序的顶端,其稳态失调会导致许多发生于胎儿发育或幼儿期的早发性疾病,如特纳和唐氏综合症。此外,多能干细胞也能够支持组织修复,因此它们修复功能的异常与肿瘤发生和组织变性相关。

为了保护干细胞群免受损伤,生物具有保守的应激反应途径,可以检测并缓解广泛的不利条件。许多干细胞存在于缺氧环境中,并依赖糖酵解作为主要的能量来源,这限制了DNA、脂质或蛋白质的氧化损伤程度。如果过多的活性氧(ROS)积累,这些细胞会稳定转录核因子E2相关因子2 (NRF2)来激活氧化应激反应。NRF2驱动具有清除氧化分子功能的蛋白质表达,并将氧化的蛋白恢复到其有功能的还原状态。抗氧化信号激活失败会损伤干细胞的自我更新和分化,以及组织的自我维持功能。此外,应对蛋白质错误折叠、DNA损伤或缺氧环境时,激活应激反应也能保护干细胞的完整性。

与它们的快速激活相对应,应激反应必须在细胞内稳态恢复后很快关闭。不能关闭氧化应激反应的干细胞无法积累信号传导所需的ROS,并且无法分化。机体处于持续缺乏ROS或还原性应激状态也会阻碍胰岛素信号传导和葡萄糖稳态,并减弱运动对胰岛素敏感性的积极作用,随后诱发心肌病、肥胖或糖尿病,并增加死亡率。总之,细胞长期处于还原应激状态会导致众多严重后果,因此亟需探究细胞感知并缓解还原应激的机制。

应激反应通常由泛素化控制,这种修饰的特异性是由数百个E3连接酶赋予的。Kelch 样ECH 关联蛋白1 (KEAP1)与Cullin-3 (CUL3)和RBX1配对形成E3 CUL3KEAP1复合物,该蛋白可将NRF2隔离并泛素化。当细胞经历氧化应激时,CUL3KEAP1受到抑制,NRF2在细胞核内积累,驱动抗氧化基因表达。肿瘤抑制蛋白VHL也能够与Cullin-3和RBX1配对形成E3 CUL2VHL复合物,进而抑制HIF-1a的功能,直到缺氧应激使该转录因子稳定表达,从而启动血管生成。VHL或KEAP1的缺失分别导致胚胎期或出生后早期死亡,这凸显了准确的应激信号传递的重要性,并且它们的突变是癌症的常见原因。还原应激是否也受泛素依赖性应激反应的控制,以及其对发育的重要性还尚未研究。

本篇文章中,研究人员利用成肌细胞分化的氧化还原敏感通路鉴定了CUL2FEM1B和它的靶蛋白卵泡蛋白相互作用蛋白1 (FNIP1)是还原性应激反应的核心成分。线粒体失活而无法积累信号传导所需的ROS或其他抗氧化信号会逆转FNIP1中保守Cys残基(小编注:即FNIP1同源蛋白质序列中都含有的保守残基)的氧化状态,即还原Cys中的二硫键,而FNIP1是CUL2FEM1B与底物结合的先决条件(小编注:首先,FNIP1降解子中的三个Cys以及相邻的His残基都是FEM1B结合和蛋白酶体降解所必需的,其次,进一步研究发现CUL2FEM1B仅结合处于还原状态的FNIP1,不结合氧化型蛋白)。随后FNIP1的泛素化和蛋白酶体降解增加线粒体输出,产生ROS,并保持氧化还原稳态。因此,还原应激反应是建立在泛素依赖性调节基础上的,其根据细胞需求调节线粒体输出,并将脊椎动物的应激和发育信号结合起来。


敲黑板啦!

1. 缺乏活性氧(ROS)或氧化应激减少抑制肌生成;

2. 还原应激可以逆转FNIP1中保守Cys残基的氧化;

3. 只有还原型FNIP1才会被CUL2FEM1B多聚泛素化;

4. FNIP1降解导致线粒体激活以重新校准ROS。



研究结果


1 还原应激抑制成肌细胞分化

作为一种依赖氧消耗的组织,肌肉是研究氧化还原应激中调节蛋白的重要组织。首先,研究人员联想到Cullin-Ring-E3连接酶(CRLs,一个已知控制应激和发育信号传导的E3蛋白家族)是否在体外的肌肉生成中是必需的。他们分别从C2C12成肌细胞中通过siRNA敲减7种Cullin蛋白表达,并通过肌球蛋白重链(MyHC)染色观察肌管形成。结果表明,CUL2和CUL3对肌管形成尤为重要(拓展图1A),这与前人研究中的CUL3敲除对小鼠肌肉发育的影响是一致的。

CUL2和CUL3通过包含VHL盒或BTB结构域的接头蛋白选择它们的底物。结合质谱以及CUL2和CUL3亲和纯化技术,研究人员在成肌细胞或肌管中检测到19个CUL2和32个CUL3接头,其中包含一些潜在的接头蛋白,如肌肉萎缩症蛋白质myoferlin和家族性肌病相关的因子KLHL9。将这一列表与来自其他细胞类型的接头蛋白结合后,他们从成肌细胞中敲减156个CRL2和CRL3亚基(小编注:CRL(Cullin-RING ligase)E3泛素连接酶是细胞内最大的多亚基泛素连接酶家族,由Cullin蛋白(CUL)、RING-finger蛋白(RBX1/RBX2)、接头蛋白及底物识别蛋白组成。作者通过质谱和亲和层析在成肌细胞和肌管中筛选出了一些CUL2和CUL3的底物接头蛋白,随后将这些蛋白结合另外三篇文献中,在293T等其他细胞系中筛选的CUL2和CUL3接头蛋白,共同得到156个CRL蛋白组分。因为其中包含了CUL2和CUL3,故通过上一级专有名词指代。简单而言,CRL2/3亚基包含了CUL2/3和它在多种细胞系中的底物接头蛋白),随后对细胞开始分化,并通过显微镜检查和自动图像分析记录MyHC阳性肌管(图1A)。

筛选结果显示,CUL3的接头蛋白KEAP1、BTBD9、KLHL22和ANKFY1是肌管形成所必需的,而CUL2的接头蛋白fem1同源物B(FEM1B)的敲减极大地促进了肌管分化(图1A-1C)。由于这些接头缺失对细胞数量的影响很小(拓展图1B),因此异常细胞分裂或存活不太可能是细胞命运特征发生变化的原因。然而,文献表明所有肌管形成所需的接头蛋白都与疾病有联系:KEAP1的突变导致肺和肾癌,BTBD9突变触发不宁腿综合症和失眠,KLHL22过表达推进乳腺癌发展,ANKFY1的突变导致激素耐药型肾病综合征。

研究人员发现,氧化应激传感器KEAP1的敲减抑制了成肌细胞的分化。KEAP1的遗传敲除会使NRF2长期稳定表达,并引发还原应激(小编注:还原应激的现象包含ROS减少,以及NADH、NADPH和GSH等还原当量上升)。成肌细胞中的KEAP1敲减诱导NRF2(图1C和1D)及其靶基因(图2E和2F)的积累,这导致NADPH水平增加(拓展图1C)和氧化型应激标志物ROS急剧下降(小编注:作者在图1E中标注的为H2O2,但是原文却写成“a steep drop in ROS, the hallmark of reductive stress”,并且后文对这张图的解释也同样是ROS。因此我们认为可能是作者标注有误,已更改原文)(图1E)。当研究人员通过siRNA敲减NRF2或谷胱甘肽合成/再循环酶来减弱这种抗氧化信号时,可以恢复成肌细胞分化。(图1D和图1F;拓展图1D)。线粒体源性ROS的清除剂(小编注:作者在C2C12分化期间添加ROS清除剂S1QEL1.1和S3QEL 2,这两种小分子药物能够通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ产生ROS,进一步施加还原压力)也抑制了成肌细胞分化(图1G)。因此可以得出结论,还原应激会在体外损害肌生成,与文献中使用KEAP1抑制剂通过Nrf2介导成肌细胞分化抑制的结果一致。虽然这支持了ROS发挥关键信号作用的观点,但也带来了以下问题:在正常发育过程中,还原应激是如何被感知和抵消的。

图1 还原应激抑制肌管形成