徐凌燕
代谢学人--小鼠原代肝细胞提取之实操篇
2021-11-20 22:34
阅读:7899

代谢学人

小鼠原代肝细胞提取之实操篇


文 | 李国强 孟美瑶

编辑 | 孟美瑶





引言


相信经过上期的介绍,不少小伙伴已经心痒难耐了吧。

小编也是磨刀霍霍向猪羊,啊,不,小鼠……


这就去.png


小编去做准备工作了,大家实验台见喽~~


温故知新


首先,我们再来回顾一下上周的“芝士”——传递门:小鼠原代肝细胞提取之准备篇

1、肝脏是人体“核心的”代谢器官,与高血压、高血脂、糖尿病等代谢性疾病密切相关。肝细胞在肝脏参与的各种代谢过程中发挥了主要作用。肝细胞是实质细胞,在肝脏中的比例最多;此外实质细胞还包括少量的胆管内皮细胞。而非实质细胞则包括星状细胞,巨噬细胞,NK细胞,成纤维细胞等,只占整个肝脏细胞的20%左右。

2、原代肝细胞的优点:①原代肝细胞由于离体时间短,因此其能够保持在体内的生物学特性,是更接近体内环境的研究模型。②原代肝细胞能够避免体内实验时肝脏其他细胞对肝细胞的影响,从而得出更加准确的研究结果。③原代细胞相比体内实验具有更好的可控性。

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小伙伴再来确认一下,是否万事俱备,只待提取~(可别学笔者,总是丢三落四的哦图片

小编的备忘录

1、 4套剪刀镊子,高温高压灭菌(分别用于剪皮,开腹,剪断下腔静脉和剪下肝脏,肝脏剪碎)。

2、配置好的灌流液,消化液(一定要37℃预热!!!)。重悬过程中用的DMEM一定要预冷!!!

3、适龄的,为人类科研事业献身的“杰瑞”

4、灌流泵调节好转速



原代肝细胞提取对于肝脏研究是必须掌握的一项实验技能。本实验采用两步灌流法提取原代肝细胞,操作简便,活细胞获得率高,细胞活力好。为后续的研究提供了良好的基础。


让我们开始吧~

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实验步骤


Step1:麻醉小鼠(小鼠年龄最好年轻一些),喷酒精,擦干后固定小鼠


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(无菌最重要啦~)



2

Step2:打开小鼠腹腔,找到肝门静脉和下腔静脉


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Tips:开腹过程一定要注意防止鼠毛进入腹腔。小编贴心提示可以将身体两侧皮肤用针头翻到侧旁后,用针头固定,可使腹腔尽可能暴露,便于寻找血管和观察肝脏灌流、消化情况。


拓展阅读

肝脏结构小知识

肝脏是血液较为丰富的器官之一,其原因在于肝脏接受门静脉与肝动脉的双重血液供应。门静脉主要负责运输携带营养物质的血液入肝,是肝脏的功能性血管,其血流量约占肝脏总流量的3/4。门静脉入肝后,分为左右两支,分别进入左右叶,在小叶间反复分支形成小叶间静脉,终末支进入肝血窦。肝动脉主要负责运输携带氧气的血液入肝,是肝脏的营养性血管。肝动脉入肝后在肝内分支形成小叶间动脉,其终末支也进入肝血窦。血液在肝血窦与肝细胞进行物质交换后汇入中央静脉。中央静脉血液进入小叶下静脉,小叶下静脉汇合为2-3条肝静脉,出肝后注入下腔静脉。

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肝脏血管示意图

3

Step3:肝门静脉插入留置针,蠕动泵调至 30(流速约为 5ml 每分钟),使用蠕动泵进行灌流液(Buffer Ⅰ)灌流,并打开下腔静脉,直到肝脏没有血冲出



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(手要稳稳的哦~)

拓展阅读

留置针

留置针,又称套管针。核心组件包括可以留置在血管内的柔软导管/套管,以及不锈钢穿刺引导针芯。使用时将导管和针芯一同穿刺入肝门静脉内,当导管进入血管后回撤出针芯,此时会观察到有微量血液流入套管内。打开灌流泵,进行后续实验操作。使用留置针的好处在于刺入门静脉,针芯回撤后,留在血管内的是柔性导管,不易刺破血管,便于后续的灌流操作。


4

Step4:换胶原酶Ⅳ继续进行灌流消化,至肝脏柔软


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Tips:消化到恰到好处至关重要。为了保证消化到位,在消化液灌入肝脏消化开始后,用无菌棉签或静脉夹夹闭下腔静脉,夹闭位置位于下腔静脉开口上方,靠近开口处。使得肝脏膨大,然后放开,如此反复数次。直至观察到肝脏表面呈现蜂窝状,用镊子轻触肝脏,会留下小洞,此时消化刚刚好。若消化不到位,则提取不到足量的细胞,且过滤网时需要用较大的力度去辅助研磨,易造成肝细胞的机械损伤,导致提取失败。若消化过度则会引起肝细胞死亡,导致活细胞得率大幅度降低。

 

Step5:下肝到有 10ml Buffer Ⅱ的10cm dish 中,修去非目的组织;过筛:100um 筛网过滤消化好的肝脏组织,用 DMEM 培养基辅助冲洗



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Tips:在剪下肝脏那个的过程中要注意保证肝脏的完整性,不要有破损。过筛的时候用5mL注射器的胶塞轻轻研磨,辅助过滤。研磨不能过于用力,会造成肝细胞的机械损伤。消化好的肝脏在轻轻触碰后肝膜即破裂,肝细胞会自然进入DMEM中,顺着液体过筛后进入下方离心管中。


Step6:50g 离心 2min,弃上清,再加入DMEM 培养基重悬(重复四次)


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Tips:重悬的时候一定要注意用移液器轻轻吹打,吹打动作要轻柔。刚刚经过胶原酶消化的肝细胞极其脆弱,过于用力会导致肝细胞破碎,提取失败。



Step7:最后一次弃上清,然后加入 10% FBS DMEM 培养基重悬,细胞计数,铺板



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Tips:成功的提取,活细胞数量一般在80%-90%之间。铺板密度要合适,一般采用6孔板 1X105~106/孔。由于肝细胞沉降较快,因此在铺完一块板后记得轻轻吹打剩余的含细胞培养基,重悬均匀后再继续铺板。



Step8:6 小时后换液,之后每天换液。一般情况下,首次换液 48 小时后可以进行实验。


下一关.gif

关卡:肝原代提取【状态:通关】


总结


各位小伙伴看完是不是感觉也没有那么困难,许多实验中的小细节还需要各位根据自己实验室的条件和操作习惯进行摸索,多加练习,总结一套适合自己平台的方案。想当年小编也是经历了多次的摸索才总结出这套活细胞得率高、细胞活力好的实验方法~

科研道路千万条,实验技术独木桥。祝各位实验顺利,paper大发!

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