代谢学人--Nature 揭秘脂肪产热新机制

2021-10-17 13:28

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代谢学人

Nature 揭秘脂肪产热新机制

撰文 | 许赛男陈俊桐仲银召邱瑾

编辑 | 孟美瑶

无效循环是什么？

听起来不太重要的样子

却让我们可以抵御寒冷

维持产热

小胖子们注意了！

利用无效循环增加产热

本文让我们一起来解密无效循环中的那些事儿

可以为减肥助力哦！

Nature近期发表的工作Mitochondrial TNAP controls thermogenesis by hydrolysis of phosphocreatine中揭示了线粒体中TNAP（组织非特异性碱性磷酸酶，由Alpl编码）作为产热脂肪中的PCr（磷酸肌酸）磷酸酶来发挥作用，介导FCC（无效肌酸循环）来参与脂肪组织产热作用。作者发现产热脂肪细胞中的TNAP借助GPI（糖基磷脂酰肌醇）的锚定定位于线粒体。运用化学和遗传学的方法抑制脂肪TNAP活性的研究表明，TNAP在FCC和适应性产热过程中起着关键作用。

❀敲黑板啦！

1. TNAP是冷诱导型PCr磷酸酶

2. TNAP借助GPI锚定在线粒体间隙中发挥功能

3. TNAP通过水解PCr来支持FCC适应性产热

4. TNAP的缺失会促进肥胖

❀背景介绍

由于肥胖会导致代谢性疾病的发生，例如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和多种癌症，因此脂肪组织受到了研究人员的广泛关注。两种特殊类型的脂肪细胞，即棕色和米色脂肪细胞，具有氧化放能和支持适应性产热的特征，能够将机体的化学能以热能的形式耗散掉。因此，它们作为功能性产热脂肪细胞，在抵御寒冷、治疗肥胖以及肥胖相关的代谢性疾病方面有重要价值。有研究表明，在人类婴幼儿体内存在一定量的棕色脂肪细胞，但其随着年龄的增长而退化，直至成年时完全消失。过去对成年人体内是否存在产热脂肪细胞有一定争议，现阶段已经证实成年人体内也存在产热脂肪细胞，并能够被多种因素诱导激活、进行产热。

虽然适应性产热具有重要的代谢功能，但其分子机制仍不清楚。在过去的研究中，人们普遍认为UCP1（解偶联蛋白1）是哺乳动物中唯一的“产热素”，通过解偶联氧化磷酸化与ATP合成，利用质子梯度来产生热量，维持体温。在近交系的UCP1敲除小鼠中，冷暴露会严重损害棕色脂肪线粒体的电子传递链。UCP1是公认的产热效应因子，即纯遗传背景的UCP1敲除小鼠（同源小鼠，纯种）需要UCP1来保持体温，而混合遗传背景的UCP1敲除小鼠（非同源小鼠，杂种）仍有抵御寒冷的能力。这表明UCP1的产热效应在小鼠抵御寒冷中只贡献了一部分。此外，猪身上虽缺乏UCP1基因，但其依旧能够维持体温，这表明哺乳动物中存在着UCP1非依赖性产热途径。

在过去的几年中，研究人员发现了脂肪组织产热的新途径：UCP1非依赖性产热途径，其基础是无效循环机制。无效循环是由一系列酶催化的，通过水解ATP将化学能转化为热能的底物循环反应。无效循环的主要生理功能是产热和代谢调节，目前对FCC、Ca²⁺循环产热、TAG-脂肪酸转化机制等无效循环研究较多。（具体机制详情请翻阅“代谢典藏丨产热脂肪：超越你想象”）。本文介绍的FCC，即肌酸和PCr的无效底物循环，其本质是在肌酸激酶和磷酸酶等一系列酶催化下，发生连续的肌酸的磷酸化和去磷酸化，从而消散PCr的高能电荷，并释放大量热量的循环反应。

FCC (无效肌酸循环)

本文的Spiegelman课题组在2017年即在Cell Metabolism上发表前期研究，通过生化、药理和遗传学证据表明，FCC途径是脂肪组织产热的重要组成部分。蛋白质组学和转录组学数据也表明，该途径对人体脂肪产热很重要。当肌酸代谢受到抑制时，人源棕色或米色脂肪细胞的产热呼吸受到明显抑制，提示FCC在脂肪组织产热过程中具有重要意义，但关于FCC机制上的问题仍有待探究。PCr与ATP能够释放相等的能量，均可作为高能磷酸盐的贮存分子和穿梭分子。理论上，FCC可能涉及PCr的直接水解，但生物医学文献中未描述过细胞中FCC相关酶的活性。

在本项研究中，Spiegelman课题组在前期基础上，发现在产热脂肪中存在PCr磷酸酶--由Alpl编码的TNAP，其以GPI锚定的方式定位于线粒体膜间隙，并能够水解PCr再生成肌酸，从而启动肌酸去磷酸化和下一轮无效循环。本文对产热脂肪中TNAP进行研究表明，TNAP可以参与FCC，并支持适应性产热。

拓展阅读——同类系小鼠与非同类系小鼠

同类系小鼠，如近交系小鼠（inbred mice），是指近交程度相当于20代以上连续全同胞或亲子交配，近交系数达98.6%以上、群体基因达到高度纯合和稳定的小鼠。本文中所提及的纯遗传背景小鼠是指129/SvImJ 或 C57BL/6J回交十代的小鼠（属于同类系小鼠），其基因组中等位位点纯合低于近交系小鼠。

非同类系小鼠，如远交系小鼠（outbred mice），是指来自随机交配亲本、个体间遗传背景各异的小鼠。本文所提及的混合遗传背景小鼠即指129/SvImJ 和C57BL/6J杂交后代小鼠。

❀研究结果

1.产热脂肪中PCr磷酸酶活性

为了评估产热脂肪中的PCr磷酸酶活性，作者将PCr与在4℃冷暴露2周的小鼠产热脂肪线粒体蛋白提取物共同孵育，使用³¹P NMR（核磁共振）监测PCr的消耗和Pi（无机磷酸盐）的产生（图1a，b）。通过这种方法，作者发现肩胛间BAT（含有棕色脂肪细胞）和腹股沟iWAT（含有米色脂肪细胞）的线粒体蛋白提取物具有PCr磷酸酶活性（附图1a）。为进一步表征其活性，研究人员采用超速离心法将冷诱导后的BAT线粒体蛋白提取物分离为可溶性和不溶性两部分，并用非离子型去垢剂NP-40溶解其不溶性部分。随后，作者比较两种成分，在不溶性部分中检测到了PCr磷酸酶活性，并通过快速蛋白液相色谱技术对不溶性部分进行蛋白纯化（图1c，d）。同时，由于心肌细胞也含有丰富的线粒体，作者也纯化了4℃冷暴露2周小鼠心脏线粒体蛋白提取物，并相对于正常温度小鼠BAT和4℃冷暴露2周小鼠心脏的线粒体蛋白提取物而言，只有在冷适应小鼠的BAT线粒体提取物中，才能检测到明显的PCr磷酸酶活性（图1d）。该结果表明，相较于其他组织而言，在冷诱导的BAT线粒体中PCr磷酸酶的活性较高。

2.TNAP是冷诱导型PCr磷酸酶

作者采用离子交换色谱法对图1d中峰进行进一步纯化，最终显示酶活性的部分被洗脱为一个窄峰（附图1b）；随后，对洗脱出的活性部分（馏分a）和低活性部分（馏分b）进行了定量质谱分析。由肝型碱性磷酸酶基因Alpl编码的蛋白TNAP在活性馏分的富集程度是低活性馏分的7倍，同时活性馏分中的PCr磷酸酶水解活性也较高（图1e）。这一结果也通过western blotting实验（检测内源性TNAP的抗体对活性组分中的TNAP的作用效果）得到了验证（附图1c）。此外，经高特异性TNAP抑制剂SBI-425处理后，BAT线粒体蛋白提取物中的PCr磷酸酶活性降低（附图1d）。最后，通过分析Ribo-seq（核糖体印迹测序）数据库数据表明，寒冷状态下，Alpl的表达在棕色和米色脂肪中分别显著增加31.4倍和18.8倍（图1f）。

说明低温能够诱导产热脂肪中Alpl的表达。编码TNAP的Alpl mRNA在许多组织中广泛表达，尤其在肝脏、肾脏和骨骼中。在骨中，成骨细胞通过促进MV（膜限制性基质囊泡）内部的羟基磷灰石晶体形成和生长，并通过将晶体传播到胶原细胞外基质上来使骨基质矿化。TNAP 具有水解 PPi（无机焦磷酸盐）的能力，对促进成骨细胞矿化很重要，但TNAP是否能水解产热脂肪中PCr仍不清楚。作者发现，纯化的重组人TNAP也具有水解PCr的能力（附图1e-g），说明TNAP具有组成型活性。

以上结果表明，低温能够诱导产热脂肪中肝型Alpl的表达，并且由Alpl编码的TNAP能够水解PCr。即产热脂肪中表达的TNAP是冷诱导型PCr磷酸酶。

拓展阅读——TNAP（组织非特异性碱性磷酸酶）

TNAP为碱性磷酸酶的一种，体内至少有4种不同但相关的碱性磷酸酶：肠道、胎盘、胎盘样和肝/骨（非组织特异性，由Alpl编码）。前3个共同位于2号染色体上，而组织非特异性形式位于1号染色体上。

Alpl通过剪接产生骨型和肝型两种mRNA，但它们的成熟蛋白氨基酸序列相同，很难从化学上区分具有相同氨基酸序列的肝型和骨型。临床上，肝型和骨型 TNAP可根据电泳行为的差异进行区分。骨型Alpl mRNA在骨、肝和肾中表达，但肝型主要在肝中表达。

本文中，作者没有特别提到肝型和骨型的鉴别的方法，但是通过联系上下文，作者应该是与骨型Alpl进行了区分，进而定位到肝型Alpl。

参考文献：

Baba, T. T. Archives of Oral Biology, 2019, 98, 32–37.

拓展阅读——Ribo-seq（核糖体印迹测序）

核糖体印迹测序，又称Ribosome profiling，或Ribo-seq，是一种基于被核糖体保护的mRNA片段的深度测序方法。对这些片段的纯化和测序，可提供具体时间点某一细胞内处于活动状态的所有核糖体的“快照”。该信息可以确定细胞中哪些蛋白在活跃地进行翻译，是研究翻译组学的一种主要的技术手段。

该技术通过使用翻译抑制剂使正在翻译的mRNA序列固定在核糖体上。加入核酸酶处理不受核糖体保护的mRNA，分离核糖体并提取纯化核糖体上未被消化的短片段mRNA（大约30nt），进而获得正在翻译的mRNA序列。这项技术可获得实时全转录组正在翻译的序列信息，使研究者能从分子水平检测蛋白组的翻译情况，并了解蛋白质的翻译水平及翻译过程，对细胞转译流程进行系统性监控并预测蛋白质丰度，在蛋白翻译机制的研究领域中有广阔的应用前景。

图1.产热脂肪线粒体中低温诱导PCr磷酸酶TNAP的分离与鉴定

附图1.产热脂肪PCr磷酸酶的活性和TNAP

3.TNAP定位于线粒体

先前研究报道称，TNAP是一种位于细胞表面的分泌型蛋白酶类，并不包含明显的线粒体靶向序列。然而，附图 1c 和 3e 表明TNAP存在于BAT 的线粒体成分中。首先，作者通过免疫荧光实验检测过表达TNAP的情况下，TNAP在产热脂肪细胞和其他类型细胞（白色脂肪细胞、BAT前体脂肪细胞、肝脏细胞、肌管细胞和人肾小管上皮细胞）内的分布情况。发现TNAP在BAT细胞的线粒体中大量表达，并与经典的线粒体蛋白HSP60共定位。而在其他类型细胞中不存在线粒体共定位的现象（图2a和附图2）。随后，作者研究了内源性TNAP在WT（野生型）和Alpl-KO（Alpl敲除型）棕色脂肪细胞中的亚细胞定位。附图3a表明，在WT棕色脂肪细胞中，大量TNAP与线粒体共定位，而Alpl-KO棕色脂肪细胞中几乎不存在与线粒体的共定位（附图3a-c）。此外，在其他类型细胞（白色脂肪细胞、BAT前体脂肪细胞、肝脏细胞、肌管细胞和人肾小管上皮细胞）的线粒体中并未检测到内源性TNAP的存在（附图3a，d），这一结果与作者先前的研究相一致。总之，这些数据表明：在产热脂肪细胞中TNAP可定位于线粒体，并且这种定位是产热脂肪细胞特异性的。

有研究报道，TNAP可通过与GPI（糖基磷脂酰肌醇，在内质网管腔内合成）相连锚定在生物膜上。因此，作者研究TNAP在线粒体膜的锚定方式是否也是如此。作者将BAT线粒体蛋白提取物的不溶性部分（研究结果1中检测到该部分提取物有PCr磷酸酶活性，其中还有其他的跨膜蛋白，如VDAC1-a）用特异性水解磷脂酰肌醇的磷脂酶处理，目的是将GPI水解，判断TNAP是否通过GPI锚定物连接到线粒体膜。经过处理后，TNAP很容易从线粒体膜上分离，而VDAC1-a（线粒体跨膜蛋白）仍然与线粒体膜相连（附图3f）。研究表明，线粒体TNAP确实通过GPI锚定物连接到线粒体膜上。

图2.TNAP靶向棕色脂肪细胞的线粒体

附图2.非产热脂肪细胞中异位表达TNAP的线粒体定位

附图3.BAT和非产热脂肪细胞中内源性TNAP的定位

4.TNAP的超微结构定位

为了探究TNAP定位于线粒体的超微结构，作者制备了TNAP-APEX2（抗坏血酸过氧化物酶，详见拓展阅读）融合蛋白（附图4b），并在稳定表达线粒体荧光报告基因的棕色脂肪细胞过表达TNAP-APEX2（附图4a）。通过免疫荧光实验检测到了线粒体内APEX2催化底物分子产生的荧光信号（Alexa Fluor 64），证实了TNAP定位于线粒体的结论。（附图4c）。

随后，作者将表达TNAP-APEX2的棕色脂肪细胞用DAB（3，3'-二氨基联苯胺）/H2O2染色，并使用OsO4（四氧化锇）进行固定，用于电镜观察。作者发现TNAP-APEX2在线粒体内膜和IMS（线粒体膜间隙）高表达，且许多高表达区域与嵴结构重合（图2b）。因此，作者猜想TNAP可能定位于线粒体间隙或内膜。为了进一步确认TNAP的线粒体亚定位，作者对线粒体进行蛋白酶保护实验，将胰蛋白酶与纯化的线粒体混合孵育，并在不同浓度的digitonin（洋地黄素，破坏线粒体外膜和不同浓度下选择性破坏内膜）的作用下通过western blotting检测线粒体释放蛋白的量。结果显示，digitonin处理下的TNAP与已知的IMS定位蛋白，如甘油-3-磷酸脱氢酶和细胞色素c的蛋白质丰度基本一致（附图4d，e）。

拓展阅读——Tyramide（酪胺）的过氧化物酶反应原理

Tyramide（酪胺）是APEX2（抗坏血酸过氧化物酶）的底物，能够被水解成酶促产物，酶促产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，在该部位产生大量的生物素沉积，生物素与随后加入的Alexa Fluor 647标记分子产生荧光，并放大荧光的信号，从而实现TNAP-APEX2融合蛋白的定位。

APEX2是抗坏血酸过氧化物酶，APEX2的酶活性不受细胞内蛋白定位的影响，可以在几乎所有的亚细胞区域保持活性，APEX2可以催化DAB（3，3 ' -二氨基联苯胺）形成DAB聚合物，进而被OsO4（四氧化锇）染色实现标记，通常用于免疫电镜中蛋白的标记和定位。

本文中作者构建TNAP-APEX2融合蛋白，可以电镜分析TNAP的亚细胞定位。同时，由于APEX2是抗坏血酸过氧化物酶，作者通过在线粒体内检测到了过氧化物酶活性，证明TNAP定位于线粒体。

拓展阅读——蛋白酶保护实验

蛋白酶保护实验通常被用来研究细胞器蛋白，并通过与其他膜反应试剂（如去垢剂、洋地黄素、Lubrol WX、渗透压缓冲液）等一起作用来研究蛋白的细胞器亚定位。

具体反应原理为：在细胞器悬浮液中添加外源性可溶性蛋白酶，当蛋白质和蛋白酶接近时，即可水解/降解蛋白质；如果蛋白质存在于一个完整的细胞器内，那么它就会抵抗蛋白质水解。若想进一步研究细胞器膜蛋白时，可采用TritonX-100（非离子型去垢剂）温和地释放膜蛋白，此时膜蛋白暴露在蛋白酶体系中，被蛋白酶水解；当用超声波处理细胞器时，细胞器会破裂，释放基质内蛋白，并迅速形成包裹基质蛋白的新的囊泡。

本文中想要研究TNAP的线粒体亚定位，作者通过将冷暴露7天的小鼠产热脂肪细胞的线粒体与蛋白酶混合孵育，并加入不同浓度的洋地黄素，洋地黄素在低浓度的时候能够破坏线粒体外膜，此时的线粒体外膜以及线粒体外的蛋白最先被水解，随后被水解的为IMS中的蛋白质，随着洋地黄素浓度的升高，以及线粒体渗透压的改变，内膜也被破坏，内膜蛋白以及基质中的蛋白也被释放，从而在相对较长的时间后被水解。因此，作者发现在不同浓度的洋地黄素处理后的western blotting结果中TNAP与IMS定位的蛋白质蛋白水解速率（可视化的为检测到的蛋白丰度）相一致，而外膜蛋白在其前被水解（蛋白丰度较低），内膜蛋白和基质内蛋白在其后被水解（蛋白丰度较高）。

参考文献：

Francisco T. Methods Mol Biol. 2017;1595:27-35.

附图4.BAT线粒体的TNAP-APEX2邻近性荧光标记的和胰蛋白酶保护实验

5.TNAP在FCC和产热中的作用

根据上述的研究结果，作者猜想TNAP可能通过FCC参与适应性产热作用。为了验证这一点，作者通过shRNA来沉默原代棕色脂肪细胞中的Alpl表达，发现Alpl沉默特异性地减少了棕色脂肪细胞在去甲肾上腺素刺激下的呼吸速率（附图5a-c）。为了明确TNAP具体的代谢功能，作者使用SBI-425来抑制TNAP的活性（图3a），在线粒体缺失ADP的条件下，SBI-425处理抑制了冷暴露小鼠的iWAT线粒体中肌酸诱导的呼吸速率（在ADP缺失的条件下，ATP产生受到抑制，使得测得的OCR仅仅是由于产热即无效循环所贡献的，在这个条件下抑制TNAP再去测量OCR才能够证明TNAP对于无效循环中的作用）。上述结果表明抑制TNAP活性会削弱FCC（图3b，附图6a）。值得注意的是，在肌酸缺失的情况下，抑制TNAP对ADP依赖的线粒体呼吸作用没有影响（附图6b）。尽管之前的研究表明，在体外实验中TNAP有很高的ATP酶活性，这些结果有效地排除了TNAP作为ATP酶影响呼吸作用的可能。同时，肌酸还促使棕色脂肪细胞的线粒体释放出过量的ADP，而SBI-425处理后的线粒体消除了这一效应（图3c）。总之，这些数据表明，线粒体定位的TNAP促进了产热脂肪细胞的FCC。

为了进一步分析抑制TNAP能否阻断线粒体内的PCr水解，作者使用了MITO-Tag（快速线粒体纯化方案），对线粒体代谢物进行检测（图3d）。利用该方法纯化的线粒体可检测到线粒体代谢物和蛋白质水平的提高，说明MITO-Tag可以有效的富集线粒体（附图7a，b）。随后，作者对纯化到的线粒体代谢物进行质谱分析，结果显示，抑制TNAP后，PCr是变化最为显著的线粒体代谢物之一，其水平增加了65%（图3e，f）。此外，抑制PCr水解会导致ATP水平升高（尽管不显著）。这些数据表明，在产热脂肪细胞的线粒体中，TNAP作为PCr磷酸酶，参与FCC，在产热中发挥作用。

为了研究TNAP在体内对能量消耗的影响，作者通过注射CL316，243（β3肾上腺素能受体激动剂）刺激小鼠的适应性产热，发现在给予SBI-425（TNAP抑制剂）后，小鼠全身能量消耗水平大幅度降低（30%）（图4a，b），而基础呼吸、身体运动或食物摄入方面没有变化（图4b，附图8a）。相比之下，在adipo-Alpl敲除（脂肪特异性缺失TNAP）的小鼠中，SBI-425依赖的呼吸的抑制作用完全消失（图4c，d，附图8b）。总之，这些数据提供了强有力的证据，表明脂肪组织中的TNAP活性有助于适应性产热作用。

拓展阅读——MITO-Tag（快速线粒体纯化方案）

线粒体是一种膜结合的细胞器，可进行细胞代谢和哺乳动物生理所必需的大量化学反应。快速线粒体纯化方案是指从哺乳动物细胞中快速分离线粒体并定量线粒体代谢物的基质浓度。

David M Sabatini课题组2017年在Nature protocol发表文章描述了快速免疫纯化线粒体代谢物谱以及基质代谢物的绝对定量的方法。该方法利用HA标记的线粒体的高亲和磁IP(免疫纯化)，在细胞匀浆后12分钟内实现线粒体的快速分离。线粒体代谢物使用LC/MS(液相色谱和质谱)进行分析，基质浓度通过LC/MS、免疫印迹、共聚焦显微镜和容量分析的方法综合计算。

参考文献：

Chen WW. Nat Protoc. 2017 Oct;12(10):2215-2231

图3.TNAP的缺失通过抑制水解磷酸肌酸的活性来消除FCC

附图5.沉默Alpl对细胞呼吸的影响

附图6.TNAP抑制对无效肌酸循环的影响

附图7.富含线粒体代谢产物和蛋白质的快速线粒体纯化

附图8.SBI-425处理后小鼠的运动和食物摄入量

6.TNAP的缺失会导致肥胖

Spiegelman之前的研究（Kazak L. Cell Metab. 2017）表明，FCC已被证明在饮食诱导的产热中具有重要作用。在高脂饮食条件下，脂肪组织特异性敲除Gatm的小鼠由于饮食诱导的能量消耗受到了抑制，因此容易出现饮食诱导的肥胖。因此，作者通过研究HFD（高脂饮食）下的adipo-Alpl敲除小鼠来探索TNAP在全身能量平衡中的作用。HFD情况下，与对照组小鼠相比，adipo-Alpl敲除小鼠的体重增长更快（图4e），脂肪量更多（图4g），但两组小鼠瘦肉、食物摄入量和运动量没有明显变化（图4f，h，附图9c）。此外，代谢笼结果显示，HFD下的adipo-Alpl敲除小鼠的整体能量消耗低于对照组（附图9a，b）。因此，TNAP有保护小鼠免受饮食诱导肥胖的作用。

作者还观察到在adipo-Alpl敲除小鼠中，CL316，243诱导的产热没有明显受损，可能是由于UCP1以及参与氧化代谢的其他蛋白质的上调对产热的代偿作用（附图10b-d）。当脂肪特异性敲除Gatm（肌酸代谢核心酶）或Ckb（人脑型肌酸激酶）抑制小鼠FCC时，也观察到同样效果。此外，UCP1的代偿性上调并未伴随着mRNA丰度的增加，这表明UCP1的代偿性作用受到转录后调控（附图10e，f）。