徐凌燕
Cell Metabolism: 肠道微生物重塑与脂肪产热
2021-10-4 15:24
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   Cell Metabolism:肠道微生物重塑与脂肪产热

文 | 仲银召 陈俊桐 徐鑫铭 许赛男 邱瑾

编辑 | 孟美瑶


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每周一期的文献精读又来喽!


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                                                                         听说肠道菌群益处多多

还可以改善肥胖 !


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小胖子们快来学习吧~


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❀背景介绍
 

        肠道微生物在肥胖中发挥重要作用,已有大量研究表明肠道微生物可经由其代谢产物影响宿主基因表达,调控机体代谢。例如Akkermansia muciniphila(阿克曼菌)可直接改善宿主代谢健康,其可通过降解粘蛋白产生多种发酵产物,包括SCFA等,与肠上皮细胞上的Toll样受体结合,促进上皮细胞增殖、IgA分泌到肠腔以及抗菌肽的表达,从而改善代谢紊乱。近期的研究发现宿主基因也会影响肠道微生物,如T细胞中髓样分化因子88基因缺失会致使肠道尿球菌减少。HIF-2α(低氧诱导因子-2α)是细胞应对缺氧胁迫的关键调节因子,在调节肥胖的代谢方面起着关键作用。HIF是一种异源二聚体,由一个氧敏感α活性亚基和一个起结构性作用的β亚基组成。虽然异构体HIF-1α和HIF-2α在结构上有48%的同源性,其皆可激活VEGF、EPO、ET-1和NOS等下游靶基因,但其功能不尽相同,HIF-1α 主要介导急性期的低氧反应,而HIF-2α主要应对慢性低氧期的机体反应。当HIF在低氧状况下被激活后,其可抑制TCA循环和ETC活性,缓解ROS损伤、抑制ROS产生等。研究发现肠道微生物可以产生抑制HIF-2α活性的代谢物(而对HIF-1α表达并无影响),从而减少宿主对肠道铁的吸收。作者之前的研究发现肠道HIF-2α信号在肥胖期间被特异性激活,但肠道微生物是否参与其中尚未研究。

    Cell Metabolism近期发表的工作“Intestinal hypoxia-inducible factor 2α regulates lactate levels to shape the gut microbiome and alter thermogenesis”详细阐明了肠HIF-2α特异性敲除通过调节肠道乳酸—B.vulgatus/R.torques(普通拟杆菌/扭链瘤胃球菌)—胆汁酸—脂肪TGR5信号通路促进白色脂肪产热,改善肥胖的分子机制,为宿主—菌群—宿主相互作用的机制研究提供新的理论依据,同时为肥胖及相关代谢疾病的防治提供了新的菌源靶点及干预策略。

        本研究中,作者发现HIF-2α可通过促进肠道Ldha(乳酸脱氢酶A)表达提高肠道乳酸水平,从而调控B.vulgatus(Bacteroidesvulgatus,拟杆菌)和R.torques(Ruminococcus torques,扭链瘤胃球菌)丰度的平衡。在肠特异性缺失HIF-2α致使B.vulgatus和R.torques失衡,使得TCA(牛磺酸结合胆酸)和DCA(脱氧胆酸)的丰度显著增加,同时激活了WAT(白色脂肪组织)中的TGR5,使得UCP1及CKMT2表达上调以促进机体产热。该研究阐明了肠道HIF-2α的缺失可改善小鼠肥胖。同时,这项研究也证明了宿主基因可通过代谢物来调控肠道微生物的相关机制



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❀敲黑板啦!

1、肠HIF-2α缺失可重塑肠道微生物,诱导体重减轻。

2、肠HIF-2α通过乳酸脱氢酶调节肠道乳酸水平。

3、乳酸可提高多糖利用率并促进B. vulgatus的生长。

4、胆汁酸谱和脂肪产热的变化促使了体重减轻。



❀研究结果

1.肠特异性缺失HIF-2α改变B.  vulgatus和R.torques之间平衡及胆汁酸谱 


与HIF2αfl/fl(对照组)小鼠相比,HIF2α△IE(肠特异性缺失HIF-2α)小鼠高脂饲喂6周后,摄食量无变化(附图1B),但由高脂饮食引起的体重、体脂含量的增加以及胰岛素敏感性均得到了显著改善(附图1A-J)。为了观察肠特异性缺失HIF-2α引起肠道微生物的变化,作者通过全基因组鸟枪测序对仅高脂饮食喂养一周的HIF2αfl/fl和HIF2α△IE小鼠的盲肠内容物进行分析。结果表明,两组之间的肠道微生物α多样性并无显著变化(图1A),但肠道微生物的组成及丰度(β多样性)有显著差异(图1B)。HIF2αfl/fl鼠的肠道菌群以B.vulgatus及相关种类如Parabacteroides distasonis(狄氏副拟杆菌)、P.merdae(粪副拟杆菌)为主,而HIF2α△IE小鼠则以R.torques等梭菌目为主(图1C- D)。此外,HIF2α肠道的特异性缺失可降低肠道B.vulgatus丰度,提高R.torques丰度(图1E-F)。

胆汁酸是一类重要的代谢物,对包括肥胖在内的多种疾病具有广泛影响,而B. vulgatus具有很强的BSH(胆盐水解酶)活性,在胆汁酸的生物转化中起重要作用。梭菌目微生物,如R.torques,可通过胆汁酸诱导基因促使初级胆汁酸转化。基于B.vulgatus和R.torques之间平衡发生的变化,作者检测了肠道和血清中各类胆汁酸的水平,结果发现,HIF2α△IE小鼠中TCA、T-βMCA、DCA均显著提高(图1G-H)。肠道微生物与胆汁酸之间的相关性分析表明,R.torques与DCA水平呈正相关,B.vulgatus与TCA和T-βMCA水平呈负相关(附图1K)。



 拓展阅读——B.  vulgatus/R.torques影响胆汁酸代谢的机制

B. Vulgatus中存在BSH(胆盐水解酶),BSH能催化共轭胆盐水解形成氨基酸和游离胆汁酸,从而起到维持胆汁酸代谢平衡的作用。

R. torques中存在7β-HSDH(7β-羟化类固醇脱氢酶)。7β-HSDH是高效生物合成UDCA(熊去氧胆酸)的关键酶,促使初级胆汁酸转化。7β-HSDH可将初级胆汁酸中的CDCA(鹅去氧胆酸)转化成UDCA。此外,UDCA是治疗原发性胆汁性肝硬化和人胆固醇胆结石的有效药物,临床上主要用于治疗胆疾。

参考文献:

[1] Song Z. Microbiome. 2019.

[2] Zheng, M.M. Process Biochem. 2015.



拓展阅读——WGS(全基因组鸟枪测序)
        WGS是一种生物测序方法,先将一条完整的目标序列随机打断成小的片段,分别测序,然后利用这些小片段的重叠关系将它们拼接成一条一致序列。
具体步骤
1. 利用非特异DNA酶随机切断DNA,建立高度随机且DNA片段长度为1kb~2kb的基因文库
2. 进行高效,大规模的单末端测序和双末端测序;
3. 对测序结果进行序列拼接并排除连锁匹配的错误;
4. 构建λ文库进行缺口填补,得到完整基因序列。 
优点:速度快,简单易行,成本较低。
WGS最初主要用于测定微生物基因组序列。后来通过WGA完成了果蝇和人类基因组的测序工作,证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。

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拓展阅读——肠道微生物α多样性与β多样性
        人体内存在着多种多样的微生物,约占体重的1%至3%,其中肠道中微生物尤为丰富。越来越多的研究表明,肠道微生物与抑郁、精神分裂和退行性疾病等密切相关。
        肠道微生物α多样性是反映个体内肠道菌群的多样性,其不涉及个体间的比较;肠道微生物β多样性是对个体间微生物组成进行比较分析,代表了肠道微生物总体的组成和丰度。


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图1.肠道特异性HIF-2α敲除调节肠道共生细菌的组成和胆汁酸谱



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附图1.肠道HIF-2α可改善肥胖和胰岛素抵抗





 2.肠特异性缺失HIF-2α通过降低肠道乳酸水平抑制B. vulgatus丰度


为了探究肠特异性缺失HIF-2α抑制肠道B.vulgatus丰度、提高R.torques丰度的潜在机制,作者比较了HIF2αfl/fl和HIF2α△IE小鼠盲肠提取物对B.vulgatus和R.torques生长的影响。结果发现,HIF2α△IE小鼠盲肠提取物降低了B. vulgatus的生长速率和最大生长浓度(图2A),但两组提取物均对R.torques无显著影响(附图2A),表明HIF2α△IE小鼠中R. torques的增加可能是由于微生物互作而非特定代谢物产生的作用。

为了探究影响B.vulgatus生长的特定代谢物,通过顺序多固相萃取和高效液相色谱技术发现,与HIF2α△IE小鼠相比,HIF2αfl/fl小鼠的组分3-3-4显著促进了B.vulgatus的生长(附图2B-E)。为了确定组分3-3-4中促进生长反应的成分,作者通过NMR(核磁共振)比较1H和13C NMR谱图与标准品的谱图,确定乳酸为主要代谢物(图2B和附图2F)。进一步研究发现,乳酸可直接促进B.vulgatus的生长并呈剂量依赖性(图2C),但并不影响R.torques的生长(附图2G)。与此一致的是,HIF2α△IE小鼠的总盲肠内容物、回肠和组分3-3-4中乳酸水平显著降低(图2D-E,附图2H)。综上所述,乳酸能直接促进B.vulgatus的生长,而HIF2α△IE小鼠由于缺乏乳酸致使B.vulgatus的丰度较低。



拓展阅读——弯弯曲曲的小肠(small intestine)

        小肠分为十二指肠(duodenum)、空肠(jejunum)和回肠(ileum)三部分,是连接胃的幽门部,长约6~7米的管道。由十二指肠开始,经空肠、回肠在腹腔内曲折下行,在右下腹部与盲肠(cecum,大肠的开始部位)相接。
各部分结构特点
1.十二指肠:自幽门部开始呈“J”字型弯曲,与空肠相接,长约25~30厘米。胆囊和胰脏由一根细管与十二指肠相连,向十二指肠输送在消化上起重要作用的胆汁和胰液。胆汁可乳化脂肪使其易于消化,胰液则是含有糖、蛋白、脂肪等消化酶的强力消化液。
2.空肠和回肠:在腹腔里曲折下行通向盲肠部,其黏膜有许多皱褶。而且黏膜表面生长着密密麻麻的称为绒毛的小突起,使小肠的吸收面积显著扩大,同时又加快了吸收速度。两者之间是没有明显界线的,空肠位于腹腔的左上侧,回肠位于右下侧。空肠稍粗,由于有很多血管分布而微带红色。


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文献中常见的检测的是
:盲肠内容物
1. 根据研究目的:如研究有明确发病部位的疾病——十二指肠溃疡、盲肠炎、溃疡性结肠炎、结直肠癌等,首选发病部位的肠道内容物。
2. 在不确定取样部位时,优先取盲肠内容物:盲肠的细菌种类和数量最多,因此常被作为代表性研究部位。





3. 乳酸提高多糖利用并促进B. vulgatus生长


接下来,作者试图探究乳酸介导的促进B.vulgatus生长的潜在机制。作者发现,在B.vulgatus生长期间,培养基中乳酸浓度保持不变,这表明乳酸不是B.vulgatus的碳源(附图2I)。随后,对乳酸或PBS处理的B.vulgatus进行RNA-seq。GO分析结果表明,乳酸处理后,大分子和细胞大分子代谢过程相关功能的通路被富集(附图2J)。

有研究表明,拟杆菌属具有利用并降解大分子能力(主要是多糖),故而能够加速其生长。为了研究乳酸补充是否通过增加多糖利用促进其生长,作者比较了不同碳源下B.Vulgatus的生长情况,结果发现在菊粉和木聚糖(可被B.vulgatus利用)存在情况下,补充乳酸都能显著加速其生长,而当单糖葡萄糖作为唯一碳源时,补充乳酸对B.vulgatus的生长促进作用微乎其微(图2F-H)。上述结果表明,乳酸是通过刺激多糖利用来促进B.vulgatus的生长。

为了探索乳酸可增加多糖利用的潜在机制,作者通过GO分析发现,乳酸处理后,涉及转录调控的功能被富集,如核苷酸结合、核苷磷酸结合和核酸结合(附图2K)。通过对差异基因进行分析发现,B.vulgatus σ因子 (BVU_RS16825)显著上调(图2I),σ因子是细菌RNA聚合酶全酶的一个可分离亚单位,负责转录起始。σ因子可被各种外部环境条件刺激,进而调节细菌生长,而拟杆菌属σ因子能够感知环境刺激并调节与多糖利用相关的基因的表达。综上,作者猜想乳酸可能作为一种环境刺激物,影响B.vulgatus中σ因子的表达,从而刺激多糖利用率并促进B.vulgatus生长。

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图2.肠特异性缺失HIF-2α通过降低肠道乳酸水平抑制B.  vulgatus丰度


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附图2.乳酸提高多糖利用并促进B. vulgatus生长




4.HIF-2α通过调节Ldha(乳酸脱氢酶A)的表达调节肠道乳酸水平


为了探究HIF2α△IE小鼠中乳酸水平降低的机制,作者检测了小鼠回肠中乳酸代谢和转运相关的基因表达,结果发现,HIF2α△IE小鼠的Ldha表达显著降低,此外回肠中LDH(乳酸脱氢酶)活性也显著降低(图3A-B)。然而,盲肠内容物中的总LDH活性保持不变(图3C)。这些结果表明,肠道特异性缺失HIF-2a降低了宿主Ldha的表达,从而降低了盲肠和回肠内容物中的乳酸水平(图2D-E)。

为了进一步探索HIF-2α是如何调控Ldha表达的,作者首先对Ldha的启动子进行了分析,并在Ldha启动子区域中预测出两个HIF反应元件(HRE),即HRE1和HRE2(图3D)。通过对小鼠回肠原代细胞进行ChIP分析发现,CoCl2(一种缺氧模拟剂)增强了HIF-2α与HRE1而非HRE2的结合(图3E)。荧光素酶报告分析显示,过表达HIF-2α后,Ldha启动子的转录活性增加。HIF-2α诱导的Ldha启动子转录活性的增强可在HRE的双突变或HRE1的单突变后被消除,但不受HRE2突变的影响(图3F),以上结果表明HIF-2α通过结合Ldha启动子中的HRE1直接上调Ldha表达



拓展阅读——乳酸代谢

         乳酸是含有羟基的羧酸,可作为碳水化合物和非必需氨基酸代谢中间体,在机体内发挥广泛作用。在真核生物体内,LDH(NAD依赖的乳酸脱氢酶)催化乳酸至丙酮酸之间的可逆性反应,即乳酸可由LDH通过丙酮酸无氧糖酵解产生;在氧气充足下,也可被LDH通过逆反应转换成丙酮酸,丙酮酸随后可在线粒体中被氧化为二氧化碳和水。此外,乳酸还可通过丙酮酸形成丙氨酸、脂肪酸等物质被机体利用,也可随尿液和汗液直接排出体外。

1. LDH(乳酸脱氢酶):LDH为含锌离子的金属蛋白,分子量为135-140kD,是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一,主要有LDHA(M)、LDHB(H)两种亚基, LDHA(M)负责将丙酮酸转化为乳酸和NAD+,而LDHB(H)将乳酸转化为丙酮酸,它们可构成多种四聚体同工酶。本文中的LDHA即为肠道内的LDH同工酶中的一类,促进氧化代谢。各型LDH在不同组织中的分布有差异:心肌中以LDH1(H4)及LDH2(H3M)的量较多,而骨骼肌及肝脏中以LDH5(M4)和LDH4(HM3)为主。这种分布的差异与各组织利用乳酸的生理过程的差异有关,即LDH1和LDH2对乳酸的亲和力大,使乳酸脱氢氧化生成丙酮酸,有利于心肌从乳酸氧化中获得能量。LDH4和LDH5对丙酮酸的亲和力大,有利于丙酮酸还原为乳酸,这与骨骼肌在无氧酵解中获得能量的生理过程相适应。

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2. MCT(单羧酸转运蛋白):MCT是位于细胞膜的蛋白载体,可介导乳酸穿梭,即将血液中的乳酸输送到氧化能力强的组织细胞中进行氧化代谢。

3. GLO1(乙二醛酶1)和HAGH(羟酰基谷胱甘肽水解酶):属于生物解毒酶系统中的反应酶,能将机体有害物质如MG(丙酮醛)转换成无毒的乳酸盐排出体外。

参考文献:

[1] Geoifnon M Du x et al. 2014.

[2] PyoPHoffmn et al. 2007.




 5.乳酸处理逆转HIF-2α缺失的有益影响


        为了进一步阐明乳酸是否参与肠道特异性HIF2α缺失对肥胖的改善作用,作者采用直接给予直肠低剂量乳酸的方式,分别处理HIF2αfl/fl和HIF2α△IE小鼠6周。结果发现,乳酸处理组肠道内容物乳酸水平显著升高,然而血清中乳酸水平并无变化(图3G-H),表明乳酸可能极大地局限于肠腔并发挥局部微生物群调节作用。此外,乳酸处理对摄食量并无显著影响,但可显著提高HIF2αfl/fl和HIF2α△IE小鼠体重及体脂含量,降低其葡萄糖耐受及胰岛素敏感性(图3I-P)。这些结果表明,肠道乳酸的减少有助于HIF-2α缺失所介导的对肥胖和肥胖相关性胰岛素抵抗的改善作用。


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图3乳酸处理逆转HIF△IE的有益作用

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 6.肠道微生物群介导HIF-2α缺失的有益影响


抗生素处理清除小鼠肠道微生物后,作者发现肠道HIF-2α的缺失不再改善肥胖或胰岛素敏感性,这表明了肠道微生物的重要性(附图3B–E)。接下来,作者通过FMT (粪便微生物移植)实验来确定是否可以回复肠道HIF2α缺失产生的表型。结果发现,HIF2α△IEFMT小鼠(移植HIF2α△IE粪便微生物小鼠)肠道B.vulgatus丰度显著降低,R. torques丰度显著提高(附图3F)。此外,HIF2α△IEFMT小鼠体重及体脂含量降低,胰岛素敏感性显著提高(附图3H-O)。与HIF2α△IE小鼠的结果一致,HIF2α△IEFMT小鼠的血浆和肠道DCA、TCA和T-βMCA水平显著高于HIF2αfl/flFMT小鼠(附图3P-Q)。综上所述,肠道HIF-2α缺失的代谢益处主要是由肠道微生物介导的。

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附图3.肠道微生物介导肠缺失HIF-2α的有益影响





7.肠道特异性HIF-2α缺失通过促进脂肪组织产热来改善肥胖


众所周知,产热在对抗肥胖方面起着重要作用,为了进一步确定产热是否是肠道微生物群影响HIF-2α缺陷小鼠肥胖的主要机制,作者检测了高脂喂养6周并用乳酸或PBS处理的HIF2α△IE和HIF2αfl/fl小鼠的产热指标。结果发现,HIF2α△IE和HIF2αfl/fl小鼠在热中性条件下具有相似的直肠温度;但在24小时冷刺激后,与HIF2αfl/fl小鼠相比,HIF2α△IE小鼠直肠温度更高(图4A)。接下来,作者研究肠道HIF2α的缺失对WAT和BAT产热的影响,作者使用红外成像技术监测了腹股沟区和肩胛间区的腹侧和背侧温度,在热中性条件下,两个区域的局部温度没有明显差异(图4B-C和附图4A)。在冷刺激后,两种基因型小鼠表现出相似的肩胛间温度,但HIF2αfl/fl小鼠的腹股沟区域温度的下降更为显著(图4B-C和附图4A),这表明HIF2α△IE小鼠WAT的冷诱导产热得到改善。此外,当对高脂喂养的HIF2α△IE小鼠同时经直肠给予乳酸处理时,冷暴露后直肠温度和腹股沟温度显著降低(图4A-C),表明乳酸抑制了HIF2α△IE小鼠的机体产热。

HIF2αfl/fl和HIF2α△IE小鼠在热中性条件下,无论是用乳酸还是PBS处理,其能量消耗和RER(呼吸交换率)基本一致(图4D和附图4B)。在冷刺激条件下,HIF2α△IE小鼠的全身能量消耗显著高于HIF2αfl/fl鼠,但能耗过程会受到乳酸的抑制(图4D)。

与此一致的是,HIF2α△IE小鼠腹股沟脂肪和附睾脂肪的基础耗氧率较高(图4E-F),进一步证明了HIF2α△IE小鼠WAT产热能力提高。此外,WAT而非BAT中产热基因显著上调(图4G-H),UCP1和米色脂肪标志物在附睾脂肪组织中几乎检测不到,但与CKMT2通路相关的基因在附睾脂肪组织中显著上调(图4H)。UCP1和CKMT2都被认为是白色脂肪细胞产热的关键调节因子,其表达量升高会促进产热。此外,HIF2α△IE小鼠腹股沟脂肪中UCP1蛋白表达显著增加(图4I),腹股沟和附睾脂肪中的CKMT2也显著上调(图4I和4J),并且腹股沟及附睾脂肪组织线粒体中肌酸激酶的活性也显著提高。而乳酸处理后极大地消除了上述有益影响,表明B.vulgatus-乳酸轴参与了HIF2α△IE小鼠机体产热(图4A-J,附图4A-F)。

抗生素清除肠道微生物后,肠道HIF-2α的缺失不再改变WAT中的产热(附图4G–J)。此外,HIF2α△IE小鼠直肠/腹侧/背侧温度、能量消耗、呼吸交换率、体外耗氧率以及产热基因和与肌酸循环相关基因表达的所有改变均可在HIF2α△IEFMT(HIF2α△IE粪便移植小鼠)中重现(图4K-R,附图4K-M)。在HIF2α△IEFMT小鼠中,腹股沟脂肪中的UCP1水平以及腹股沟和附睾脂肪中的CKMT2水平较高,并且腹股沟和附睾脂肪中线粒体CK活性均上调(图4S-T,附图4N-O)。这些结果表明,HIF2α△IE小鼠的肠道微生物主要通过腹股沟脂肪组织中的UCP1以及腹股沟和附睾脂肪组织中的肌酸循环促进产热。



拓展阅读——CKMT2及其调控通路

        CK(肌酸激酶)主要存在于ATP需求高的组织中,如骨骼肌、心脏和大脑中。本文提到的CKMT2(线粒体肌酸激酶2)是CK同工酶中的一种,在棕色脂肪细胞线粒体内可催化肌酸发生可逆的磷酸化作用,作为FCC(无效肌酸循环)的反应酶来调控能量代谢。

        有研究发现,CK可以受到AMPK途径和PKC途径蛋白激酶的磷酸化调控。如AMPK(AMPK依赖蛋白激酶)和PKA (蛋白激酶A)、PKC (蛋白激酶C)可增强CK的活性。CaMK(钙调蛋白依赖性蛋白激酶)在某些情况下也可影响CK的磷酸化修饰作用等。此外,有研究报道β3-肾上腺素可通过cAMP途径激活CK表达的方式促进产热:cAMP可激活PKA ,PKA的催化亚基结合CREB蛋白,促进CK基因的表达。

参考文献:

[1] Bak et al, Dieni and Storey, 2009.

[2] Rahbani JF,et al. Nature. 2021.


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图4肠特异性缺失HIF-2α经由肠道微生物诱导WAT产热


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附图4肠特异性缺失HIF-2α经由肠道微生物改善WAT产热





8.肠道HIF-2α敲除小鼠的肠道菌群通过激活WAT中TGR5缓解肥胖


TGR5是胆汁酸的关键膜受体,与对照组小鼠相比,HIF2α△IE和HIF2α△IEFMT鼠腹股沟和附睾脂肪组织中TGR5的基因表达显著增强(附图5A-B),而TGR5激活可导致cAMP水平升高(图5A-D)。

为了验证脂肪TGR5在肠道HIF-2α基因敲除小鼠中的作用,作者构建了TGR5△Adipo(脂肪组织特异性TGR5缺乏)的小鼠模型(附图5C–F)。肠道HIF-2α敲除小鼠的肠道微生物调控了WAT中TGR5的表达,通过将HIF2α△IE和HIF2αfl/fl小鼠粪便微生物移植到TGR5△Adipo小鼠,即TGR5△AdipoHIF2αfl/flFMT小鼠 和TGR5△AdipoHIF2α△IEFMT小鼠,来确定肠道微生物引起的肥胖改善是否依赖于脂肪组织中的TGR5。来自HIF2α△IE和HIF2αfl/fl小鼠的粪菌移植并未改变TGR5△Adipo鼠的摄食量、体重、体脂含量及胰岛素敏感性(图5E-L,附图5G)。此外,根据体温、产热基因及与肌酸循环相关基因的表达水平的结果可以看出,在TGR5△Adipo小鼠中,由HIF2α△IE小鼠FMT引起的产热被消除了(附图5H-J)。而且TGR5△AdipoHIF2αfl/flFMT 和TGR5△AdipoHIF2α△IEFMT小鼠腹股沟或附睾脂肪组织中的CKMT2或UCP1水平并无差异(附图5K-L),线粒体肌酸激酶活性也无差异(附图5M-N)。综上所述,脂肪TGR5信号在肠道微生物移植引起的代谢改善中起着关键作用。




拓展阅读——TGR5及其相关信号通路

        胆汁酸受体可分为膜受体和核受体两类。TGR5属于GPCR家族的膜受体,表达在细胞膜上,TGR5的激活导致受体内化,可激活多种信号通路来调节机体生理过程。而FXR(法呢醇X受体)、PXR(孕烷X受体)和VDR(维生素 D受体)属于胆汁酸核受体,即当胆汁酸与核受体结合后,核受体构象发生变化,激活受体与另一核受体成员RXR(维甲类X受体)结合形成异源二聚体,并结合到靶基因启动子上发挥转录调节作用,调节相应靶基因的转录。通常,胆汁酸核受体主要与脂类代谢相关;而膜受体主要与糖代谢相关。

        TGR5 (G蛋白偶联胆汁酸受体Gpbar1)是 G蛋白偶联受体超家族成员。TGR5不仅是胆汁酸受体,也是多种选择性合成激动剂的受体,在肝脏和脂肪组织中参与调节不同信号通路,如AKT、NF-κB和ERK1/2通路。

1. TGR5与AKT信号通路

TGR5受体可通过AKT信号激活mTORC1(mTOR蛋白复合物1)。有研究报道,与对照组小鼠比较,发现mTORC1基因敲除的小鼠的体型变大,许多器官如心脏、胰腺也随之变大且伴有脂肪组织;此外,mTORC2(mTOR蛋白复合物2)的磷酸化可介导FoxC2的激活和抑制脂肪细胞的分化,能够抑制肥胖状态。

2. TGR5与NF-κB信号通路

       研究发现TGR5的激活抑制了 IκBα的磷酸化、 p65的易位、NFκB 的DNA结合活性及其在 HepG2细胞(人源肝癌细胞)中的转录活性,降低炎症反应。在肝脏CD14+巨噬细胞中,LCA(石胆酸)和DCA(去氧胆酸)可以通过TGR5激活c-Fos,c-Fos调节NF-κB p65蛋白的激活,抑制TNF-α、IL-6(白细胞介素-6)的分泌,抑制炎症。

3. TGR5与ERK1/2信号途径

研究发现,在TGR5-/-和TGR5+/+的肥胖小鼠中,胆汁酸模拟物在TGR5+/+的小鼠中可激活AKT蛋白表达,并促进ERK1/2的磷酸化水平,诱导线粒体的分裂,促进线粒体呼吸,从而增加了白色脂肪的消耗,与TGR5-/-肥胖小鼠相比较,TGR5+/+小鼠体脂含量下降,体型变小,说明TGR5受体在脂肪组织中可介导ERK信号通路。

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参考文献:

[1] Huang S K,et al.Am J Respir Cell Mol Biol, 2008.

[2] Perino A, et al. J Clin Invest, 2014.

[3] Laura A V, et al.2018, 254(9): 1-13.

[4] Covarrubias A J,  et al. Semin Immunol, 27(4): 286-96.


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图5 .HIF2α△IE鼠的肠道微生物通过脂肪TGR5依赖过程促进产热


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附图5. HIF2αΔIE鼠的肠道微生物通过脂肪TGR5依赖过程促进生热





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9. TCA和DCA通过脂肪TGR5依赖途径改善肥胖


上文提及肠HIF-2α缺失小鼠中TCA、DCA和T-βMCA水平上升,为了进一步探索哪些胆汁酸能够激活TGR5以促进WAT产热,作者通过荧光素酶实验证明是TCA和DCA而非T-βMCA可在体外诱导TGR5的激活(辅图6A)。为了确定TCA和DCA在体内是否可以激活TGR5,作者用两种胆汁酸(TCA和DCA)对TGR5fl/fl和TGR5△Adipo小鼠连续灌胃6周,结果表明,与TGR5△Adipo小鼠相比,TGR5fl/fl小鼠体重、体脂含量显著降低,葡萄糖耐受性和胰岛素抵抗显著改善(图6A-C,附图6C-G)。在产热方面,TCA和DCA可增加寒冷条件下小鼠的直肠温度(图6D),能量消耗(图6E)及基础氧气消耗率(图6F-G);TCA和DCA增加耗氧量进而降低TGR5fl/fl小鼠的呼吸交换率,但活动量无改变(附图6H-I)。

TCA或DCA处理的TGR5fl/fl小鼠附睾和腹股沟脂肪组织中的CKMT2表达以及腹股沟脂肪组织中的UCP1表达均升高,但TGR5△Adipo小鼠中无显著变化(图6H–K)。此外,TGR5脂肪特异性敲除消除了TCA或DCA处理后附睾和腹股沟脂肪组织中线粒体肌酸激酶活性的增强(附图6J-K)。TCA和DCA可提高附睾和腹股沟脂肪组织中cAMP水平,而当TGR5基因敲除后cAMP的水平不再升高(附图6L-M)。

为了进一步评估CKMT2在肠HIF2α-胆汁酸-TGR5-CKMT2/UCP1轴中的作用,使用shRNA敲低脂肪细胞中的CKMT2,与对照组细胞相比,shCKMT2致使其mRNA水平降低60%(图S6N)。进一步研究发现,DCA可显著增加脂肪细胞的呼吸作用,这表明DCA能够促进脂肪细胞产热(附图6O)。此外,CKMT2敲低后肌酸代谢受损,减缓了细胞呼吸(小编注:肌酸代谢是机体通过底物循环来消耗ATP的产热过程。有研究报道:线粒体的肌酸激酶可利用氧化磷酸化形成的ATP对肌酸进行磷酸化,释放与肌酸量成比例的ADP,即肌酸和ATP与磷酸肌酸和ADP呈严格的1:1的化学计量关系。通过FCC,肌酸可促进更多的APT转化为ADP,使ATP高能磷酸键中的能量以热量的形式释放,增加脂肪细胞的耗氧量,促进细胞呼吸速率,故肌酸代谢可影响细胞呼吸速率。)因此,如果将CKMT2敲低后,肌酸代谢受损,ATP的消耗减少,细胞呼吸减缓。(附图6O-P)。这些结果表明,CKMT2可能部分调节DCA的产热促进作用。



拓展阅读——胆汁酸

        胆汁酸是存在于胆汁中一大类胆烷酸的总称,以钠盐或者钾盐的形式存在,即胆汁酸盐。

       一、胆汁酸与脂代谢:有研究发现,胆固醇受体辅激活蛋白敲除小鼠存在胆盐输出泵功能缺陷,会导致三酰甘油吸收不良。此外,胆汁酸的合成速率与高脂血症患者血浆三酰甘油水平的升高相关。

      二、胆汁酸与葡萄糖代谢Ⅱ型糖尿病患者餐后血浆胆汁酸水平较血糖正常者明显升高。胰岛素能抑制胆汁酸合成的限速酶7α羟化酶,从而减少胆汁酸的合成。而葡萄糖能刺激7α羟化酶,从而增加胆汁酸的合成;牛磺酸结合的熊脱氧胆酸能够改善肥胖者胰岛素的敏感性,而考来烯胺(胆汁酸的螯合剂)能降低Ⅱ型糖尿病患者血浆葡萄糖水平、减少尿糖的排泄、降低糖化血红蛋白水平。

     三、胆汁酸与肥胖:高脂饮食导致的肥胖大鼠模型体内胆汁酸的水平明显降低,而给予小鼠胆汁酸后能够改善高脂饮食诱导的肥胖;肥胖者游离型胆汁酸和结合胆汁酸的水平略低于表观正常的对照者,但是肥胖者甘氨鹅脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸的水平却高于对照者。

     四、胆汁酸与免疫应答:胆汁酸在包括免疫细胞在内的多种细胞对于外界病毒的免疫应答中起到重要作用。实验小鼠相关胆汁酸信号流被阻断后,可出现不同程度的抗病毒能力下降、死亡率升高的现象。

TCA(牛磺酸结合胆酸)是一种常见的结合型胆汁酸,由胆酸的羧基与牛磺酸的氨基以酰胺键结合而成。它存在于很多动物的胆汁中,尤以蛇胆、牛胆及羊胆中含量最多。有研究表明,胆汁酸结合可能因饮食而异。素食饮食有利于甘氨酸结合,高动物蛋白饮食有利于牛磺酸结合。牛磺酸结合胆汁酸通过肠道微生物代谢产生硫化氢,一种基因毒性化合物。因此,牛磺胆酸有可能刺激肠道细菌,使牛磺酸和胆酸分别转化为硫化氢和脱氧胆酸,脱氧胆酸是一种基因毒素和肿瘤启动子。另外研究认为,牛磺胆酸对tnbs诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有抗炎作用。与对照组相比,牛磺胆酸可以显著抑制小鼠体重减轻,改善结肠重量和长度,同时降低MPO的活性和以及结肠中炎症基因的表达,这提示牛磺胆酸对小鼠溃疡性结肠炎具有抗炎作用,是治疗炎症性肠病的良好候选药物。

DCA(脱氧胆酸)是胆酸失去一个氧原子衍生而得的一种游离胆汁酸,在胆汁中主要以牛磺酸、甘氨酸结合的形式存在,具有促进胆汁分泌、抗炎的作用。有研究表明,初级胆汁酸在肠道菌群的作用下生成次级胆汁酸。脱氧胆酸和石胆酸可以下调NF-κB 炎症信号通路关键蛋白的表达从而发挥抑炎的作用,包括 IκBα 和 NF-κB p50 的磷酸化以及 NF-κB p65 的核易位。从而对肺炎克雷伯菌诱导的肝脓肿和菌血症小鼠具有保护肝脏和抑制炎症的作用。

参考文献:
[1] Ridlon JM,et al. Gut Microbes,2016.
[2] Yang Y,et al. Biomed Pharmacother. 2016.
[3] Zheng Y,et al. J Inflamm Res. 2021.
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图6.胆汁酸通过脂肪细胞TGR5促进小鼠产热


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附图6.胆汁酸通过脂肪细胞TGR5促进小鼠产热


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 10. B. vulgatus和R. torques通过TCA和DCA诱导的TGR5激活来调控产热


为了探究胆汁酸水平的变化以及UCP1和CKMT2的上调是否由B.vulgatus和R. torques引起的,作者对小鼠进行6周的B.vulgatus和R.torques灌胃,结果发现B.vulgatus灌胃后,可致使小鼠体重、体脂含量增加,胰岛素敏感性降低,而用R.torques灌胃结果则与之相反(图7A-C,附图7A-7F)。在产热方面,与上述结果一致,B.vulgatus和R. torques对体温、能量消耗、呼吸交换率和OCR(耗氧率)有相反的影响(图7D-G,附图7G),而活动量无显著变化(附图7H)。B. vulgatus处理的小鼠附睾和腹股沟脂肪组织中的cAMP水平较低而R.torques处理的小鼠cAMP水平更高(附图7I-J)。cAMP水平的改变也影响了CKMT2的表达和产热。在附睾和腹股沟脂肪组织中,B.vulgatus处理的小鼠,CKMT2水平和线粒体肌酸激酶活性均较低而R. torques处理的小鼠则反之(图7H-K,附图7K-L)。B.vulgatus和R.torques也影响胆汁酸水平,B.vulgatus处理后,DCA,TCA及 T-βMCA水平降低,而R.torques处理后,DCA水平显著增加(附图7M-N)。上述变化表明,B.vulgatus和R.torques的变化可能是肠道特异性HIF-2α缺失通过胆汁-TGR5- UCP1/CKMT2轴诱导WAT产热的主要原因。

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图7 B. vulgatus或R. torques处理改变产热


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附图7 B. vulgatus或R. torques处理改变产热

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 ❀总结

综上所述,肠HIF-2α可以促进LDH的表达,LDH表达升高会导致肠道内乳酸水平的升高。乳酸进一步导致肠道菌群B.vulgatus和R.torques之间的稳态失衡,进而降低DCA和TCA的水平。研究发现,DCA、TCA可以通过TGA5途径促进产热,因此DCA和TCA水平的降低可通过TGR5信号途径抑制产热。这些发现为宿主基因调节微生物机制提供了理论依据,并为治疗代谢性疾病提供了一种新的策略。

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原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34329568/


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