徐凌燕
论细胞的几种死法之铁死亡篇
2021-9-16 22:39
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代谢典藏 | 论细胞的几种死法之铁死亡篇


文 | 张婷 张彦康 平晓丹 李雨

编辑 | 孟美瑶


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图片 铁死亡的调控

 
不难想象,凡是能够调控铁死亡的生物学过程,如促进或调控这一过程的分子、氧化还原稳态和铁稳态以及细胞代谢,都可能会影响铁死亡。例如,氧化应激反应转录因子NRF2可以通过激活多个经典靶基因的表达来缓解铁死亡(详细综述另见ref 93)。此外,越来越多的证据表明,在特定条件下,多种信号通路可以控制细胞对铁死亡的敏感性。




铁死亡抑制因子的调控

虽然GPX4和FSP1在抑制铁死亡方面扮演着重要的角色,但对于细胞如何在生理和病理条件下调控GPX4和FSP1的抗铁死亡功能还知之甚少。目前已知的是,GPX4和FSP1似乎在某种程度上和甲羟戊酸途径相交集:甲羟戊酸途径是蛋白异戊稀化修饰方式之一,可以稳定Trsp(硒代半胱氨酸特异性tRNA),而Trsp是合成包括GPX4在内的硒酶所必需的,另外,如前所述,甲羟戊酸途径的终产物之一泛醌是FSP1的主要底物。

GPX4是人体内25种硒蛋白之一,它的表达受细胞内可用硒的含量调控。有研究表明,增加细胞内硒含量可以协同激活转录因子TFAP2c和Sp1来促进神经元中GPX4的表达,从而避免出血性中风小鼠的组织损伤。然而值得一提的是,和真正的硒反应蛋白如SELENOP(硒蛋白P)、GPX1和GPX3不同,GPX4可被视作一种管家蛋白,在大多数组织和器官中均有表达。其他调控GPX4表达的转录因子包括肠上皮细胞中的C/EBPα和某些癌细胞中的NF-Y。在转录后层面,GRSF1(鸟嘌呤富含序列结合因子1)能够与线粒体型GPX4 mRNA的5’非编码区结合,促进线粒体内GPX4的翻译,从而在精子发育过程中起着重要的作用。然而,以上调控事件与铁死亡的关系仍不清楚。


越来越多的证据表明,GPX4的活性和稳定性也受到调控。例如,持续的氧化应激导致GSH耗竭,这使得GPX4中硒代半胱氨酸活性位点的GSH依赖性还原受损,从而导致GPX4通过β切割过程形成无氧还活性的脱氢丙氨酸和GPX4不可逆的功能失活。低水平的GSH也可能促进亚硒酸和邻近氨基酸之间形成硒酰胺,从而保护酶免于在急性氧化应激下发生不可逆失活。然而,在缺血-再灌注损伤等病理条件下,这些机制是否发挥作用还需要进一步研究。有研究报道,肠道缺血与较低的GPX4活性和含量有关。此外,包括RSL3在内的多个铁死亡诱导剂最终都会通过硒代半胱氨酸活性位点的共价修饰、干扰甲羟戊酸代谢以及铁依赖的氧化应激等机制,破坏GPX4的活性、合成和稳定性。


作为一种重要的铁死亡抑制因子,FSP1最初是作为p53应答基因被发现的,因此FSP1还被称为PRG3(p53-responsive gene 3)。FSP1还是转录因子NRF2、CRBP和PPARα的靶基因。有意思的是,在T淋巴母细胞性淋巴瘤细胞(T cell lymphoblastic lymphoma cells)中,长链非编码RNA MEG3(母系表达基因3)上调FSP1的表达,miR-214下调FSP1的表达,而这两种RNA也同时参与肿瘤发展。除了转录调控,我们还不清楚FSP1的氧化还原酶活性是如何被调控的,以及FSP1的亚细胞定位如何调控其在不同生理、病理过程中的作用。但FSP1能够同时作用于还原性和氧化性底物(如NADH、NADPH、泛素酮和α-生育酚),表明其活性的调控过程较复杂。



铁死亡中的Hippo-YAP信号

Hippo-YAP通路具有多种生理功能,包括细胞增殖和器官大小。前期研究发现在半胱氨酸饥饿和GPX4抑制剂的诱导下,高密度生长的细胞更能抵抗铁死亡,从而暗示了Hippo-YAP通路在铁死亡中的作用。这一结果与更早的一些重要发现类似,例如在极高密度生长的细胞或将细胞进行球体培养(有利于细胞与细胞间接触)可以提高GPX4敲除细胞的生存率。从机制上来讲,细胞密度对上皮细胞铁死亡的调控作用是由上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)介导的细胞间接触所介导,其能够通过NF2(也被称为Merlin)肿瘤抑制蛋白激活Hippo信号通路,从而抑制转录辅调节因子YAP的核转位和转录活性。由于YAP靶向多个铁死亡调控因子,包括ACSL4、转铁蛋白受体TfR1等,因此铁死亡的发生最终依赖于Hippo通路的活性,抑制Hippo通路和激活YAP均可以促进铁死亡(图4)。与此一致,研究发现YAP的同源物TAZ在肾癌细胞(主要表达TAZ而不是YAP)中以调控细胞密度的方式促进铁死亡。


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图 4 | 铁死亡的调控通路

铁死亡被多种代谢事件(如脂质合成、自噬和线粒体TCA循环)和信号通路(如E-cadherin-NF2-Hippo-Yap通路,葡萄糖调节的AMPK信号通路,以及p53和BAP1的肿瘤抑制功能)调控。脂质合成过程中,由脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)和其他多种酶介导产生的含有多不饱和脂肪酸链的磷脂(PUFA-PLs)为磷脂过氧化和铁死亡所必需。细胞中的铁是铁死亡的另一重要因素,因此,转铁蛋白受体(dTfR)介导的铁输入和自噬介导的铁蛋白(ferritin)降解等过程都促进铁死亡。此外,细胞内氧化还原稳态失衡也会导致铁死亡。因此,当细胞缺少还原剂(如半胱氨酸)时,细胞代谢、特别是线粒体氧化代谢会导致ROS积累,促进铁死亡。谷氨酰胺分解代谢在半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡中发挥重要功能,这可能是由于谷氨酰胺分解代谢通过其回补作用支持线粒体TCA循环。可以想象,多种信号转导途径和转录调控因子通过调控脂质合成、铁稳态、细胞代谢和氧化应激过程调控铁死亡敏感性。例如,AMPK信号通过抑制脂质合成抑制铁死亡,而葡萄糖通过拮抗AMPK功能促进铁死亡。E-cadherin-NF2-Hippo信号通路通过减弱YAP介导的包括TfR和ACSL4的转录,抑制铁死亡。肿瘤抑制因子P53和BAP1通过抑制SLC7A11(system Xc-胱氨酸/谷氨酸反向转运体的一个亚基)的转录活性,减少还原剂胱氨酸输入细胞,从而使细胞对铁死亡敏感。
ETC:电子传递链
Gln:谷氨酰胺
Glu:谷氨酸
αKG:α酮戊二酸
PLOOH:磷脂氢过氧化物


E-cadherin-NF2-Hippo-YAP/TAZ途径在调控铁死亡方面所发挥的作用具有重要的意义。首先,由于该途径的多个环节在癌症中经常发生突变,且大多数突变促进YAP/TAZ的表达和/或活性,因此,诱导铁死亡可能是治疗这种类型癌症的潜在疗法,这个话题将在下面作进一步讨论。其次,在不表达E-cadherin的非上皮细胞中也观察到细胞密度依赖的铁死亡现象,说明其他类型的钙粘蛋白(cadherin)或细胞黏附因子也可能以类似的机制来抑制铁死亡。第三,Hippo-YAP通路在发育过程中起着重要的作用,并且该通路与其他信号通路相互作用,说明细胞铁死亡与其他正常生理功能之间存在潜在的紧密联系。最后,钙粘蛋白的表达可以追溯到原始的后生动物,因此我们推测钙粘蛋白最原始的功能可能是保护细胞免受氧化应激损伤,包括氧化应激最致命的形式--铁死亡。



AMPK信号与铁死亡

直观上讲,能量和代谢应激会引起能量损失,从而导致能量稳态维持系统的级联失衡,如能量依赖的跨细胞膜的离子浓度失衡,最终导致细胞死亡。此外,通过葡萄糖饥饿给予细胞代谢压力会促进细胞中ROS的产生,提示葡萄糖饥饿可能促进铁死亡。然而令人惊讶的是,葡萄糖饥饿实际上是抑制细胞铁死亡的,而这一抑制铁死亡的作用依赖于能量感应激酶AMPK的活性,即当葡萄糖缺乏时,AMPK被激活,能量应激保护程序被激活,通过破坏PUFAs的生物合成途径(该途径为脂质过氧化诱导的铁死亡所必须)保护细胞免受铁死亡(图4)。由于能量应激保护程序的激活可以保护肾脏免受缺血-再灌注损伤,因此该发现具有实际应用价值。在更广泛的水平上,这种保护机制可能是保护机体免受能量耗竭导致的器官损伤的第一道防线。



缺氧信号与铁死亡

考虑到由细胞铁死亡是由磷脂过氧化引起的,一直以来悬而未决的问题是该过程是否依赖于氧的浓度,因为氧分子可以被各种酶代谢为超氧阴离子(O·),再通过歧化作用形成过氧化氢(H2O2)。然而,关于铁死亡的一项早期研究表明,在1%氧环境下erastin诱导的铁死亡并没有受到影响,这表明缺氧并不会抑制铁死亡。实际上,有研究显示缺氧会促进铁死亡。首先,缺氧会导致线粒体复合物Ⅲ产生更多ROS,从而通过破坏线粒体膜直接促进脂质过氧化,随之而来的细胞H2O2水平升高能够支持Fenton反应,和/或耗竭细胞抗氧化能力来促进铁死亡。此外,缺氧可以诱导HIFs(缺氧诱导因子)的活性,最近一项对透明细胞癌(clear cell carcinoma)的研究发现,这些细胞对GPX4抑制剂引起的铁死亡高度敏感,且这一过程由HIF2α亚型所介导。HIF2α能够促使HILPDA(缺氧诱导脂滴相关蛋白)的表达,从而诱导不饱和脂质的富集。透明细胞癌在组化染色中具有特征性的透明细胞质,并且难以治疗,因而这一发现具有重要的临床意义。此外,很有可能HIF2α-HILPDA驱动的细胞铁死亡敏感性是一种古老的消除新生低氧性肿瘤的方法(见下一节)。




图片铁死亡的生物学功能

铁死亡的机制提示了其潜在进化起源:从地球上的生物开始利用氧气通过一系列化学氧化还原反应来驱动新陈代谢后,铁作为一种过渡金属已成为催化这些反应的首要元素,而ROS,包括PLOOHs,是这种依赖于铁的氧化还原代谢过程的无法避免的副产物。当细胞中PLOOHs水平高于一定阈值时,细胞就会死于铁死亡。自然的,细胞进化出GPX4和FSP1等多种监控机制来保护其免受铁死亡。因此,我们推测,铁死亡可能是在富含铁和氧的环境中出现的最原始的一种可控细胞死亡方式。

那么,铁死亡是否具有生理意义上的益处?理论上是有可能的。例如ROS和脂质过氧化氢,这些物质最初被认为是新陈代谢的有毒副产物,但现在我们知道它们具有重要的生理功能,如在细胞信号转导和免疫过程中,一些亚细胞部位通过主动产生ROS和脂质过氧化氢来调节细胞生理过程。同样地,铁死亡也可以扮演对生命有益的角色。有许多间接证据提示铁死亡在肿瘤抑制和免疫监管中的生理功能。


缺氧信号与铁死亡

多种肿瘤抑制因子都被发现可增强细胞对铁死亡的敏感性,因此,可以合理的推断铁死亡有助于这些肿瘤抑制因子的抗肿瘤活性,也就是说,抑制肿瘤可能是铁死亡固有的生理功能。

在这些肿瘤抑制因子中,p53在铁死亡中的作用已被透彻研究。通过详细分析p53的特异性赖氨酸乙酰化位点,发现p53可以通过抑制system Xc亚基SLC7A11的转录来促进铁死亡,这一功能可能有助于p53在体内和体外的肿瘤抑制功能。而且,致癌性的p53单核苷酸多态性(导致P47S氨基酸替换)可使肿瘤细胞抵抗铁死亡,但目前还不清楚这些特定突变除了使p53丧失促铁死亡活性外,是否还有其他功能。值得注意的是,与这些研究结果相反,有的研究发现p53可以通过调控其转录靶点来抑制铁死亡。考虑到p53可以调节涉及各种生物学过程的大批靶基因,p53在铁死亡中的确切作用很可能取决于其所处的特定环境。

与p53类似,肿瘤抑制因子兼表观调控因子BAP1可以通过下调SLC7A11表达来促进铁死亡。但与p53不同的是,p53的促铁死亡活性已被证明在体内足以抑制肿瘤发生,而BAP1的促铁死亡活性对肿瘤的抑制程度目前还不清楚。

在TCA循环中,延胡索酸酶催化延胡索酸转变为苹果酸,它也是平滑肌瘤和肾乳头状细胞癌中的肿瘤抑制因子。延胡索酸酶是TCA循环所必需,在细胞能量和代谢物产生中至关重要,但其为何有看似矛盾的抑制肿瘤生长的功能,且其仅在少数特定癌症中抑制肿瘤生长,仍不清楚。延胡索酸酶参与线粒体TCA循环的促铁死亡功能或许可以解释这一问题。癌症的发展往往与线粒体ROS产生增多有关,这使得这些细胞更易发生铁死亡。延胡索酸酶功能的丧失会损害线粒体的氧化功能,这一方面会阻碍细胞生长,另一方面会使细胞对铁死亡更加抵抗,从而提高细胞的生存能力和癌变的可能。


免疫监管中的铁死亡

细胞凋亡、焦亡和坏死等受调控的细胞死亡在免疫应答中受免疫系统调节,而通过外部或内部机制诱发的铁死亡是否能起到类似的“生理作用”,在很大程度上仍不清楚。一些初步证据表明,铁死亡在免疫细胞诱导的细胞死亡中起着重要的作用。一项研究表明,IFNγ(干扰素γ)抑制system Xc–的表达,而由CD8+ T细胞产生的IFNγ最近被证明可能参与了增强肿瘤细胞对铁死亡敏感性的过程。而免疫细胞对铁死亡的这种直接诱导机制是否具有生理意义目前还不清楚。另一项研究表明,IL-4和IL-3抑制某些细胞(包括肾、肺、脾和心脏)的GPX4表达,同时增强ALOX15的表达,从而促进关键的炎症中间体--花生四烯酸代谢物的产生。GPX4可以通过降低脂质过氧化物度(lipid peroxide tone)来抑制LOXs和环加氧酶(cyclooxygenases)活性,因此GPX4活性受损可能对免疫调节性脂质介质的分泌产生显著影响,这能够警告免疫系统细胞正处于铁死亡敏感的环境中,从而促进免疫监管(监测损伤或恶性肿瘤)。

铁死亡在免疫应答中的作用不仅局限于哺乳动物,在植物中也可能存在。最近一项研究表明,在水稻中诱导类似铁死亡过程的细胞死亡(与脂质过氧化有关,可被铁离子螯合剂抑制)可以通过清除被感染的细胞并阻止病原体传播来防止真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae,M. oryzae)感染。有意思的是,M. oryzae的特定细胞发生类铁死亡为其在宿主体内发育所必需。因此,这一发现也首次表明了铁死亡在发育中的潜在功能。



图片铁死亡与疾病的关系

尽管铁死亡在生理学方面的作用还不清楚,但它在众多人类疾病中的功能已被广泛研究。在这一部分,我们将重点讨论铁死亡在癌症和缺血-再灌注损伤中的作用,这也是目前研究最深入的方向。在不同的临床前动物模型中,铁死亡的药理学调控被证明是这些疾病的潜在治疗方式。另外,正如Box1中所讨论的那样,越来越多的证据表明铁死亡和其他疾病相互关联,这表明铁死亡引起的细胞死亡对健康具有广泛的影响。


铁死亡与癌症

铁死亡与癌症有关在癌症研究之初即被发现。在寻找新的癌症治疗化合物的过程中,研究人员发现了铁死亡化学诱导剂。随后对其机制的研究结果表明,如前几节所述,许多癌症相关基因和信号通路都可以调控铁死亡。一方面,对凋亡和常规癌症疗法抵抗的间充质干细胞和去分化的癌细胞,以及被称为“ 持续细胞”(therapy-persister)的癌细胞都对铁死亡诱导高度敏感。从概念上来看,铁死亡是一种氧化应激诱导的细胞死亡形式,它与细胞代谢联系密切,而癌细胞新陈代谢非常活跃,ROS含量更高,因此更容易发生铁死亡。与此一致的是,有研究发现,癌细胞通常需要摄入大量的铁,这可能使癌细胞对铁死亡更加敏感。然而,癌细胞也可能利用遗传学或表观遗传学机制来抵抗这些代谢或氧化压力,从而降低其对铁死亡的敏感性,例如上调SLC7A11或者抗氧化转录因子NRF2的表达即可以达到这一目的。因此,某种特定的癌细胞是对铁死亡更敏感还是更具有抵抗力取决于它的遗传背景。在发展基于铁死亡诱导的癌症治法时,癌细胞的基因组学以及下面讨论的其他因素应当被充分考虑。


肿瘤细胞对铁死亡的敏感性

多种肿瘤相关蛋白、肿瘤抑制因子和致癌信号转导途径都可以调控铁死亡。因此,它们在癌症中的变化可以作为生物标志物(biomarker)来预测癌细胞对促铁死亡疗法的反应。

以E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路为例,根据TCGA(癌症基因组图谱)的数据显示:在癌症中,肿瘤抑制因子E-cadherin功能缺失突变在乳腺小叶浸润癌(~65%)和弥漫性胃腺癌(~25%)中常见;NF2功能缺失突变发生在>30%的间皮瘤和所有被称为NF2疾病的良性病变中;同样地,在多种癌症中观察到Hippo通路成员LATS1/2肿瘤抑制因子的突变。虽然很少见到YAP基因突变,但YAP基因的过表达或翻译后激活却经常在肿瘤中发生。重要的是,这些基因的恶性突变通常会导致癌症转移,保护癌细胞免于凋亡,并使它们对常见的癌症疗法更具有抵抗性。因此,研究发现这些突变使癌细胞对铁死亡更加敏感,即揭示了这些恶性肿瘤细胞中少见的致命弱点,也表明了诱导铁死亡是一个独特的治疗癌症的方法。对目前缺乏有效疗法的胃癌和间皮瘤来说,这个方法极具潜力。除了E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路的突变外,我们预计在不久的将来会发现更多促铁死亡癌症疗法的生物标志物。


潜在的诱导铁死亡抗癌疗法

基于诱导铁死亡的癌症治疗正被积极研究。在这一领域,研究人员检测了多种基于非靶向纳米颗粒的策略来向肿瘤细胞内输送铁、过氧化物和其他有毒物质来杀死肿瘤细胞。此外,多种调控铁死亡的酶的发现使癌症的靶向治疗成为可能,最显而易见的靶点可能就是GPX4,因为它在大多数癌细胞中都有表达,且对癌细胞的生存起着至关重要的作用。然而,GPX4缺乏经典的小分子结合位点,而现有的GPX4抑制剂可以共价修饰GPX4和其他硒蛋白的硒代半胱氨酸残基,这会导致特异性问题和潜在毒性。另外,这些抑制剂本身具有高活性,不能在机体内稳定存在,不过这个问题可以通过研发活性位点被遮蔽的前体药物,使之在细胞内代谢转化为活性形式的方法来解决。然而,主要的障碍是GPX4在各种外周组织中起着必不可少的作用,如肾小管细胞和小鼠的某些神经元亚群,因此,除非靶向GPX4的治疗药物可以特异性地传递到肿瘤细胞中,否则靶向GPX4可能会产生严重的副作用。

与靶向GPX4不同的是,鉴于小鼠中Slc7a11敲除不会引起显著病变,且SLC3A2和/或SLC7A11的表达与黑色素瘤和神经胶质瘤患者的临床预后呈负相关,通过抑制system Xc–限制细胞内(半)胱氨酸含量的方法极具前景。事实上,药理学或遗传学抑制system Xc–来阻止各种癌症发生和转移的研究在小鼠模型中已取得了很好的结果,且该疗法具有很好的疗效和低毒性。与正常组织相比,肿瘤对system Xc–的抑制更加敏感,可能是因为肿瘤细胞中更加活跃的代谢和其他变异使其处于持续的氧化应激,因此更依赖于system Xc–来缓解ROS毒性。当然,利用抑制system Xc–这一抗癌疗法前须检测患者肿瘤组织中system Xc–和前一章节讨论的其他生物标志物的表达并进行分类(如SLC7A11过表达可能表示癌细胞更依赖于胱氨酸来清除ROS),这决定了肿瘤细胞对抑制system Xc–的敏感性。

与Slc7a11基因敲除类似,敲除Fsp1基因不会导致胚胎死亡或者出现明显的病理变化,这表明靶向FSP1有望治疗癌症。此外,FSP1在多种癌细胞系中高表达,且在860种癌细胞系筛选中发现,FSP1是介导GPX4抑制剂抗性相关基因中排名最高的基因。GPX4缺失的癌细胞可以被FSP特异性抑制剂iFSP1有效清除,而在表达GPX4的癌细胞中,iFSP1可与RSL3协同诱导癌细胞铁死亡。因此,FSP1抑制剂可能会进入临床治疗,特别是针对治疗耐药性肿瘤或者表现去分化特征的肿瘤

基于铁死亡诱导的抗癌疗法也可能与其他治疗方法相结合,例如与免疫检查点阻断治疗和放射治疗结合。与其他能够诱导肿瘤组织中的免疫原性细胞死亡治疗结合使用可以增强免疫检查点的阻断效果,因此免疫检查点阻断治疗与其他治疗方法的结合疗法一直被积极研究。有趣的是,最近有研究发现抗PDL1抗体和免疫检查点阻断治疗相结合可以增强铁死亡诱导疗法的效果。具体来说,抗PDL1抗体可以刺激CD8+ T细胞分泌IFNγ,而如前所述,IFNγ可抑制癌细胞的system Xc–活性,从而使癌细胞对铁死亡敏感。因此,免疫疗法与诱导细胞铁死亡相结合是一种很有前景的治疗方法,因为这两种治疗方法以相互促进的方式达到协同抗癌的效果。关于放射疗法,最近有研究发现,辐射本身可以诱导铁死亡,也可以与铁死亡诱导剂和免疫治疗协同作用,这提供了一种有效抗癌的联合治疗方案。这种方法的抗癌效果在细胞死亡水平、脂质过氧化水平、铁死亡相关基因表达变化和脂质组学变化方面、以及在细胞系、来源于患者的异种移植癌症小鼠模型和离体的患者神经胶质瘤细胞培养中均有体现。此外,有研究发现细胞质辐射,而非细胞核辐射,与铁死亡诱导剂具有协同抗癌作用,提示在此类疗法中,放射治疗是通过消耗GSH和诱导脂质过氧化的方式来促进细胞死亡,而不是通过其经典的DNA损伤效应。放射疗法和免疫治疗联合疗法也能提高癌细胞对铁死亡的敏感性,其中,辐照与免疫治疗通过DNA损伤激活的ATM激酶和IFNγ协同降低SLC7A11水平。最后,已有研究证明放射治疗可以上调癌细胞中ACSL4水平,从而促进脂质过氧化和铁死亡。其中的机制目前还不清楚,可能涉及了介导放射反应及铁死亡相关的转录调节因子的激活,如p53和BAP1。因此,由辐射诱导的铁死亡效应可能由多种机制介导,且依赖于胞内环境。但值得注意的是,铁死亡也被报道与一些由放射治疗引起的不良反应有关,如肺纤维化以及粒细胞-巨噬细胞造血祖细胞的死亡。


 ▼box1铁死亡与疾病的潜在联系

除了癌症和缺血性器官损伤,铁死亡已被发现与越来越多的其他疾病的发病机制有关,如神经退行性疾病、肝和肺的纤维化、自身免疫疾病、结核分枝杆菌诱导的组织坏死、与吸烟有关的慢性阻塞性肺病以及罕见的遗传性神经疾病Pelizaeus–Merzbacher。虽然这一长串的例子说明了铁死亡调控疗法具有临床意义和治疗潜力,但铁死亡是否是这些疾病的致病因素,还需要进一步研究。例如:在大多数情况下能够疾病组织中发生非凋亡性细胞死亡,而铁死亡抑制剂(通常是亲脂性自由基捕获型抗氧化剂)可以缓解这种细胞死亡,并在某些情况下改变病情的严重程度。然而,脂质过氧化物也可以调节免疫和炎症,而上述所列举的疾病都与免疫和炎症密切相关。因此,需要仔细区分亲脂性自由基捕获型抗氧化剂是通过调节炎症还是铁死亡来发挥作用,或者二者皆有。进一步研究细胞死亡相关机制,并检测体内特异性铁死亡生物标志物(很可惜的是这方面研究目前很缺乏),将是阐明铁死亡在疾病中作用的关键。

缺血性损伤中的铁死亡

缺血后再灌注可在受累器官中诱发大规模的细胞死亡和炎症反应,导致包括脑中风、缺血性心脏病和肝肾损伤在内的重大疾病。其中值得一提的是,缺血性心脏病仍然是全球致死率最高的疾病。如下所述,有强力证据表明,铁死亡是缺血-再灌注损伤相关细胞死亡的主要诱因,这至少部分是由缺血引起的氧化应激所致。这些发现表明抑制铁死亡是一种治疗缺血性损伤相关疾病的潜在治疗方法。


对大脑及心脏缺血性细胞死亡的影响

多项研究确定了铁死亡在神经元死亡如中风和其他脑损伤疾病中的作用。大鼠海马体切片体外培养实验表明自由基捕获型抗氧化剂铁抑素1(ferrostatin 1)可阻断谷氨酸诱导的神经元兴奋毒性细胞死亡。由于谷氨酸诱导的神经毒性与中风和各种神经退行性疾病有关,且高浓度的胞外谷氨酸可以通过抑制system Xc-功能诱导铁死亡,因此铁死亡可能对这些脑类疾病的发病有所贡献。与此一致的是,小鼠中条件性缺失Gpx4会引起类似神经退行性病变的症状。此外,在不同实验体系中,铁离子螯合剂和亲脂自由基捕获型抗氧化剂被用来测试对中风及神经退行性病变的改善。

在缺血性心脏病中,铁死亡的作用也得到了广泛的研究。在模拟小鼠心脏缺血再灌注损伤的体外系统中,研究表明铁离子螯合剂和谷氨酰胺分解抑制剂能显著减少心肌细胞死亡,缓解心脏组织损伤并改善其功能,这提示了靶向铁死亡在治疗缺血性心脏病上的潜在价值,且最近的小鼠模型体内研究中也进一步证实了这一观点。

为了设计可行的铁死亡靶向疗法来治疗中风和缺血性心脏这样的致命疾病,我们需要考虑许多重要因素。例如,这两种疾病都是非常急性的,只允许短时间内进行干预,因此,需考虑铁死亡靶向治疗能否及时应用,从而足够迅速地发挥其效果?此外,由于铁死亡有多种代谢途径,缺血再灌注可能通过选择性地破坏特定监控途径在不同器官中诱发铁死亡,因此我们能否开发出特异性的铁死亡抑制剂,可以有效地治疗某种疾病,而对其他器官的副作用达到最小?


在与器官移植相关的缺血-再灌注损伤中的作用

除了大脑,肾脏可能也是成年哺乳动物中对铁死亡最敏感的器官,近端肾小管细胞的存活取决于其中GPX4的功能,这些细胞容易因缺血再灌注而死亡,这也是肾移植的常见并发症。与此一致的是,在缺血再灌注损伤小鼠模型、诱导型Gpx4全身敲除小鼠和叶酸诱导急性肾损伤小鼠模型中,铁死亡抑制剂都被证明可以减轻肾小管细胞死亡和急性肾衰竭症状。由于这类细胞死亡会促进炎症,这些研究还表明铁死亡会导致固有免疫系统的激活,因而可能通过移植排斥反应来进一步阻碍器官移植的成功率。肝脏是另一种常见的移植器官,肝细胞特异性Gpx4敲除小鼠出生不久即会死亡,但高水平的维生素E饮食可以弥补肝脏中GPX4的缺乏,使小鼠存活。此外,使用自由基捕获型抗氧化剂可以保护肝实质组织免受缺血再灌注损伤。同时,铁死亡也与心脏移植有关。总而言之,铁死亡抑制剂可能是有助于各类器官移植成功的有效药物。


缺血再灌注损伤中阻断铁死亡的潜在靶点

在铁死亡代谢网络中存在多个潜在的治疗干预靶点,但在干预措施的每个节点都有其自身的风险和优势。鉴于铁死亡是由磷脂过氧化作用驱动的,那么其中一种策略就是引入阻止过氧化进程的药物。例如,可以使用亲脂性自由基捕获型抗氧化剂(如liproxstatin 1)来防止脂质过氧化自由基的扩散。这类药物在铁死亡的细胞模型中非常有效,在某些体内情况下也是如此,然而在考虑人体试验之前,还需要进一步改进其药理性质。另一种相关方法是使用化学性质上抗过氧化的PUFA,例如在容易被过氧化的双烯丙基碳上掺入氘。这种氘化PUFA已被证明是铁死亡和各种慢性铁死亡相关退行性疾病的有效抑制剂,尽管其效果不如铁抑素1和liproxstatin 1强。同样地,使用MUFA作为膜组分已被证明可以抑制铁死亡,并可作为一种潜在的治疗方法。

阻断脂质过氧化的第二种策略是通过使用铁离子螯合剂消耗掉不稳定的铁元素或者抑制促进脂质过氧化的酶类。铁离子螯合剂已经应用到许多临床适应症中,但是由于这些药剂有潜在脱靶作用,更重要的是铁元素本身具有不可或缺的生理作用,因此该方法仍存在许多安全问题亟待解决。靶向负责产生PUFA-PL和PLOOH的酶(例如ACSL4,LPCAT3,LOX和POR)的方法可能是可行的,并且这些酶类作为已知的分子靶标,很适合以靶点为核心的药物研发,但是它们在不同组织中还具有其他功能,这会使潜在的治疗结果复杂化。


图片总结和展望

将铁死亡定义为一种独特的细胞死亡方式使得先前被认为是细胞代谢中迥然不同的元素,如铁,硒,氨基酸,脂质和氧化还原化学,能够被归集到统一的网络中讨论(图1)。随着铁死亡研究的发展,人们意识到这个网络在正常生理以及多种病理等广泛的生物学过程中发挥着重要作用。接下来,本文将概述一下这一激动人心的领域内中存在的问题、面临的挑战以及潜在的成果展望。

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图 1 | 铁死亡概况

铁死亡是通过磷脂过氧化实现的,该过程依赖于过渡金属铁,ROS和含有多不饱和脂肪酸链的磷脂(PUFA-PLs)。此外,细胞代谢会通过调控ROS和PUFAs的水平调节铁死亡,多种细胞外因子也影响细胞对铁死亡的敏感性。微量营养素硒是铁死亡的一个重要调节因子,它对于生物合成一些包括谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4,关键的磷脂过氧化的抑制因子)在内的清除ROS的硒蛋白是必要的。胱氨酸(半胱氨酸的氧化形式)在被System xc-胱氨酸-谷氨酸反向转运体摄入后,也可通过促进GPX活性抵抗铁死亡(图2)。同时,细胞代谢和ROS水平被细胞内或细胞间的信号传递和环境应激调控,细胞代谢还受到营养供给调控,因此这些因素也会影响铁死亡。铁死亡导致的细胞损失与多种导致组织损伤的病理因素相关。因此,抑制铁死亡可能是治疗这些疾病的有效策略。有意思的是,许多癌细胞对铁死亡的敏感性增加,因此诱导铁死亡可以被作为抗癌疗法。铁死亡可能在肿瘤抑制和免疫监视等方面也具有生理功能,还需要进一步的研究以阐明这些功能(图中的问号)。需要注意的是,在铁死亡过程中,最终介导细胞死亡的确切机制尚不清楚,可能与膜完整性的丧失,脂质交联导致膜性质被破坏以及来源于PUFA-PL的ROS引发的生物大分子和细胞结构氧化损伤。

首先讨论该领域存在的一些问题。尽管人们越来越热衷于将铁死亡与生物学的方方面面相联系,但我们仍需谨慎严格地检测铁死亡在生物学过程中发挥的作用。不能仅用一种单一的铁死亡抑制剂能抑制细胞死亡作为充足的证据表明铁死亡参与了该生物学过程。目前铁死亡的定义是可被铁含量不足和亲脂自由基捕获型抗氧化剂同时抑制(如铁抑素1、liproxstatin 1、维生素E或泛醌)的细胞死亡过程。同时满足这两个条件至关重要,因为一方面存在与铁死亡不同的铁依赖性的细胞致死机制,例如溶酶体毒性;另一方面,独立于铁的氧化应激机制也早已被证实是存在的。我们建议增加额外的检测标准来判断铁死亡:直接检测脂质过氧化(可使用质谱、荧光染料或特异性抗体如1F83)。最近的研究显示,转铁蛋白受体(TfR1)的动员和上调也是界定铁死亡的另一个潜在标志物,这一点可用来区分氧化应激与铁死亡。除了以上两点,继续开发其他铁死亡标志物对该领域具有重要价值。除了铁死亡的定义外,该领域的另一个重要问题是使用不适合解决预期问题的实验方法——这也是在任何新兴领域都不可避免的问题。为了解决这些问题,Box2和Box3为研究铁死亡提供了一些实操指南,其中概述了在体内和体外研究铁死亡过程中所需考虑的重要内容。


 ▼box2铁死亡诱导模型使用中的潜在问题

铁死亡诱导模型通常通过干预铁死亡抑制途径中的关键组分来造模,尤其是(半)胱氨酸—system Xc–胱氨酸/谷氨酸反向转运体—谷胱甘肽(GSH)—谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)这条轴。需要考虑的是,这些干预的结果将取决于特定细胞的胞内和胞外环境。
细胞对铁死亡的敏感性不可避免的与其胞内和胞外的氧化还原状态有关。例如,由于培养基中缺乏半胱氨酸,在许多细胞系中都存在system Xc–亚基SLC7A11的表达上调,在离体培养的细胞和器官中该亚基的表达则会被快速诱导。在小鼠中,机体对Slc7a11敲除具有很好的耐受性,因为半胱氨酸会以还原态形式存在于体内,并被中性氨基酸转运蛋白吸收到细胞中,而在体外培养时几乎所有表达system Xc–的细胞系在敲除SLC7A11后都是致死的,这是因为体外培养时,培养基中所有的半胱氨酸均以氧化形式存在(如胱氨酸)。细胞培养和体内研究中显著的氧化还原状态差异使得对仅基于体外研究的结果进行解释时要更慎重。同样重要的是,当使用system Xc–抑制剂时,需要评估SLC7A11是否在待研究的细胞系中表达。令人担忧的是,目前许多可用的抗SLC7A11的抗体都是非特异性的,不适用于确定SLC7A11的表达水平。此外,由于细胞密度对细胞铁死亡的敏感性有深远影响,在基于细胞的实验分析中,这个参数需要被严格控制。
当干预GPX4的活性时,需要考虑GSH和其他含硫醇化合物甚至蛋白质硫醇都能够作为GPX4的底物。因此,当利用铁死亡诱导剂作用于(半)胱氨酸—system Xc–—GSH—GPX4轴的不同阶段时,GPX4的底物广泛性需要被特别考虑。值得注意的是,不同的血清含有不同含量的硒和维生素E。由于GPX4需要硒进行生物合成,而维生素E是一种能够抗磷脂过氧化的有效抗氧化剂,不同的细胞培养血清可能会对实验结果产生巨大影响。这个问题在使用Gpx4敲除小鼠时也存在,因为小鼠食物中维生素E含量(生育醇和生育三醇)可能有所不同,从而对Gpx4敲除小鼠的表型产生重要影响。与此一致的是,在某些情况下补充硒和维生素E已经被证明可以促进癌症,因此,在研究铁死亡时应把这些环境变量纳入考量。

 

▼box3使用药理学工具检测铁死亡时的相关实验考量

小分子工具对检测铁死亡很有价值,然而,在使用这些工具时,必须考虑一些涉及特异性、生物学相关性、药代动力学和药效动力学的问题。首先,当使用某种酶的药理抑制剂来评估该酶是否调控铁死亡时,需要确定该抑制剂本身是否是一种亲脂自由基捕获型抗氧化剂,从而具有不依赖于酶反应的铁死亡抑制效应,例如在一些涉及脂加氧酶抑制的研究中就存在类似问题。其次,需要在使用的实验体系中验证给定的小分子探针是否会影响所研究的靶点或途径。例如,在使用RSL3抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)或使用erastin抑制system Xc–胱氨酸/谷氨酸反向转运体时,必须使用生化分析或相应靶点抑制的药理学标志物来检验实验设置中的探针是否确实抑制了这些靶点。此外,当在动物实验中使用小分子化合物时,首先需要确定合适的试剂配方和给药途径,以在靶组织中达到有意义的药代动力学特征和药效学反应。由于溶解性、稳定性和/或药代动力学较差,许多在细胞实验中效果好且特异性高的小分子探针在动物模型中无法应用。某些常用方法并不适合在体内应用,包括:RSL3,溶解度低,药代动力学在体内很难衡量,这限制了其在组织或肿瘤直接注射时的适用性;erastin,同样具有低溶解度和低代谢稳定性[值得注意的是,其衍生物咪唑酮erastin(IKE)具有良好的溶解性、高稳定性,在小鼠中具有良好的药代动力学和药效学,并已在体内研究中得到验证];基于类似理由,铁抑素1也不适用于体内研究,而其他一些自由基捕获型抗氧化剂,如改良型铁抑素、liproxstatin 1和维生素E则可以在体内用作铁死亡的抑制剂。
通过干预铁元素调控铁死亡时也需有所考量。通过在培养基中添加铁(铁或亚铁)诱导或增强培养细胞铁死亡并不适用于铁死亡机制的研究,这是因为游离的铁离子遇到氧和微量脂质过氧化物(由细胞意外死亡或其他诱导剂触发的铁死亡产生)时会催化Fenton链式反应,从而放大胞外脂质过氧化作用并迅速杀死细胞。在体内实验中,使用铁离子螯合剂作为铁死亡抑制的唯一手段而获得的数据也应谨慎处理,因为耗尽铁除了抑制铁死亡外,还可能导致其他后果,且目前尚不清楚某些特定的结果是由于铁离子被螯合还是由于化合物脱靶效应所导致的。

其次,我们将讨论目前遇到的主要挑战。尽管在理解铁死亡调控机制方面取得了相当大的进展,但我们仍然不知道是什么确切的分子事件在铁死亡中最终导致细胞死亡,也即不清楚到了哪个分子节点,铁死亡会导致不可挽回的细胞死亡。目前确定的最下游步骤是PUFA-PLs的失控过氧化,过氧化的磷脂有可能造成膜损伤甚至膜穿孔,从而损害膜的完整性。然而,最近的研究发现,含有两个PUFA尾的磷脂对于驱动铁死亡别具效果,这表明脂质交联可能是铁死亡膜损伤的原因之一。在这种情况下,脂质交联导致的膜组分流动性受限可能会导致一些膜相关的重要功能的丧失,从而导致细胞死亡。当然,还存在其他的可能性,比如PUFA-PLs氧化分解成活跃的亲电分子,然后破坏其他大分子。在这个模型中,活跃的亲电分子在铁死亡中起的作用和caspase在细胞凋亡中的作用类似—使细胞内的关键结构和功能蛋白失活。我们希望在未来几年内能明确阐明铁死亡导致细胞死亡的具体机制。

最后,我们来看看铁死亡领域的潜在预期成果。精确鉴定铁死亡的体内生物标记,类似于用剪切型Caspase 3(Cleaved Caspase 3)来指示细胞凋亡的作用,对于确定这种细胞死亡模式的生理功能和治疗潜力至关重要;找到能够在非病理学背景下触发铁死亡的潜在自然诱导剂或生理信号仍然是一个燃眉之急,相信可能会在未来几年取得突破。一些分子如谷氨酸、p53、铁、辐射和PUFA-PLs可能被认为是(或接近于)诱导铁死亡的病理生理触发物。谷氨酸是一种含量丰富的神经递质,过量的细胞外谷氨酸足以抑制system Xc–功能从而导致铁死亡。自然状态下,细胞外谷氨酸的这种作用可能被用来在发育或其他生理环境下诱导铁死亡,比如在神经回路的形成过程中消除不必要的神经元。肿瘤抑制剂p53能诱导铁死亡从而抑制肿瘤发生,在存在基底脂质过氧化物损伤的情况下诱导p53可能是一种通过铁死亡清除应激态细胞的自然方法。在不同的模型系统中,高水平的铁本身可以触发铁死亡,这就表明在某些情况下,释放铁蛋白储存的铁或增加铁的输入可能是通过铁死亡清除细胞的一种手段。低到中等剂量的电离辐射已被证明可以诱导铁死亡,因此,在高剂量辐射或细胞的辐射保护性机制被破坏的情况下,可能会自然诱发细胞铁死亡。考虑到辐射水平,也有人猜测,火星上可能曾经有过生命,但由于星球表面的强烈辐射,生命消亡了或者转移到了地下。因此,可以推测,铁死亡是所有生命固有的,需要不断与之对抗——通过建立抗铁死亡机制网络,使生命得以生存和进化。抑制这些保护机制则是驱动铁死亡的自发性诱因。最后,在某些情况下,PUFA摄取和PUFA-PL合成可能足以诱导铁死亡,这种情况下,细胞会受到胞外环境中的PUFA(例如其他细胞或病原体释放出来的)诱导而死亡,或受到刺激后促进PUFA-PL合成酶类(LPCAT3和ACSL4)的表达,诱导细胞死亡。这其中的一些机制可能参与了组织大小的发育调控、肿瘤抑制或免疫系统对受感染细胞的清除。

总而言之,许多可用来阐明铁死亡发生机制以及其自然用途的理论唾手可得。这些研究将阐明铁死亡在生理和病理下功能的广度。我们还推测不久的将来,在使用特定生物标记物以及对患者发病背景精确评估的指引下,基于铁死亡的新兴治疗方法将得到开发并应用于临床。


   ▼ 名词解释

1、细胞焦亡(Pyroptosis):一种炎性、非凋亡性细胞死亡,主要发生在免疫细胞和上皮细胞中,来应对细胞内病原体感染等情况;由含有caspase的炎症小体复合物切割可以形成膜孔的gasdermin蛋白所介导。

2、程序性细胞坏死(Necroptosis):研究人员发现某些细胞中,TNFα在特定条件下不仅可以诱导细胞凋亡,还能引起细胞坏死,因此被称为程序性细胞坏死。程序性细胞坏死由RIP3激酶和MLKL介导,与炎症有关。

3、免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade):一种通过抑制信号通路(该信号通路通常抑制免疫细胞的活性)来激活免疫细胞活性的方式;从治疗上讲,抑制癌细胞的免疫检查点可以激活人体免疫系统杀死癌细胞。

4、兴奋毒性细胞死亡(Excitotoxic cell death):表达谷氨酸受体的神经元暴露于过量的谷氨酸或相关的兴奋性氨基酸中而引起的神经元细胞死亡。


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