美国《PNAS》杂志今年六月报导的一个“新病毒”已迅即被证明系源自污染

深度测序是一种非常强大和敏感的方法，但在应用时必须非常谨慎。

参与发现病原体的实验室应当及时分享他们的序列数据。

2009年10月，《科学》杂志曾首次报告了慢性疲劳综合征(CFS)与反转录病毒XMRV可能有关系。花了将近2年的时间，耗费了大量人力物力，最终发现这是一个“乌龙病毒”：该病毒来源于小鼠病毒污染的人类细胞，与CFS其实毫无关系。（参见《环球科学》：“骗人”的病毒，http://blog.sciencenet.cn/blog-347754-463995.html）

今年六月，美国《PNAS》杂志曾报导又一种“新病毒”，但不到3个月的时间就证明它是一个新的“乌龙病毒”：它来源于实验室塑料制品的污染（此类塑料制品广泛用于从临床样品中纯化核酸）。

新的“乌龙病毒”的发现（参见　http://www.pnas.org/content/110/25/10264.short，作者单位为美国NIH和中国第3军医大学等）：

在肝炎A、B、C、D或E型病毒均为阴性的中国患者血清中搜寻病原体，采用新一代测序技术在血清中发现了一种新的病毒。此病毒暂时称为NIH-CQV，具有单链DNA基因组，是一种细小病毒和环状病毒的杂交体。当人血清通过聚合酶链反应（PCR）进行筛查时，90名患者中有63名（70％）的样本是病毒阳性，而45名健康对照者的血清均呈阴性。此外，84％的患者针对病毒的IgG抗体呈阳性，31％患者的IgM抗体呈阳性（提示曾发生近期感染）。在健康对照组中，78％为IgG阳性，而IgM抗体均为阴性。作者的结论是，这种病毒在一些对肝炎A－E型病毒为血清阴性的肝炎患者中是非常普遍的。

第二个独立实验室在美国非A－E型肝炎患者的血清中也发现了同样的病毒（他们称之为PHV-1）。而第三个研究小组在来自尼日利亚的腹泻粪便样本中也发现了相同病毒。

新病毒是“乌龙病毒”的论证：

（参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24027301

J Virol. 2013 Sep 11. [Epub ahead of print]　作者单位为美国加州大学旧金山分校）

对该新病毒的置疑最初来自下述观察：由于参与发现“新”病原体的实验室及时分享了他们的序列数据，人们发现在上述所有三个实验室中所鉴定的“新型”病毒，核苷酸和氨基酸的相似性竟高达99％。常识告诉我们，来自不同地域、时间和临床环境的同一种病毒也不可能有如此高的一致性。另一个问题是，在美国的非A－E肝炎研究中，所有病人样品集合都有同样的病毒序列。这些观察结果提示可能存在病毒污染。

当对美国非A－E肝炎样品使用不同的方法重新进行核酸纯化时，所有样本中都未能检出新型病毒。“新”病毒的存在最终追溯到是由于使用了由Qiagen公司制造的离心柱纯化试剂盒。让水通过这些纯化柱，然后进行深度测序，结果都可检测到新病毒的近乎完整的基因组。

结论是用于纯化患者样本的核酸纯化柱污染了新病毒。这些离心柱，由多家厂家生产，通常是几英寸长，含有可吸附核酸的硅胶膜。将临床样品加入柱中，然后短暂离心以除去液体（因此称为“离心”柱）。核酸附着在硅胶膜上。杂质被洗脱，然后核酸借助缓冲液的加入而从硅胶中释放出来。

为什么Qiagen公司的离心柱会被细小病毒－圆环病毒杂交体污染？对公开可用的环境宏基因组（metagenomic）数据庫的搜索显示，存在与PHV-1高度相关（87%-99％核苷酸相同）的序列。从北美的太平洋海岸和俄勒冈州及智利沿海地区采样的海水中都查询到了含PHV-1序列的数据集。硅胶是离心柱的一个组件，可以用硅藻来生产。如果Qiagen公司的离心柱中的硅胶是用硅藻生产，如果PHV-1是一种感染海洋硅藻的病毒，这就可以解释污染的来源。

回过头来看，之所以很容易误认为NIH-CQV是人类的病原体，是因为它仅仅是在病人，而不是在健康人中被检测到。仍然有待解释的是为什么从病人和健康人的样品中都能检测到该病毒的抗体。然而估计NIH-CQV/PHV-1不会与任何人类疾病相关：当使用非Qiagen公司生产的离心柱时，在任何病人的样本中都没有发现PHV-1。

这个故事的教训是显而易见的：深度测序是一种非常强大和敏感的方法，但在应用时必须非常谨慎。必须小心地控制病毒发现过程中的每一步，从所使用的水到塑料用品和各种试剂。最重要的是，参与发现病原体的实验室应当及时分享他们的序列数据，在本项研究期间大家就是这样做的。

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