新冠病毒变异株在同一个体的感染期间就会出现。

美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）疫苗研究中心的研究人员4月8日在 PLoS Pathog 上发表了研究论文，题目是High-throughput, single-copy sequencing reveals SARS-CoV-2 spike variants coincident with mounting humoral immunity during acute COVID-19(高通量、单拷贝测序显示，新冠病毒剌突蛋白变异与新冠肺炎急性感染期间不断增加的体液免疫同时发生)（参考文献1）。作者的结论是：新冠病毒在单个宿主内的多样性被低估了。

在COVID-19（新冠肺炎）大流行的早期，SARS-CoV-2（新冠病毒）基因组变异率似乎很低，在任何两个分离株的约30,000碱基的基因组中平均只有10碱基差异。到2020年后期，随着感染人数的增加，分离出的变异株比以前看到的更多。

追踪SARS-CoV-2在受感染个体内的演变，将有助于阐明COVID-19的发病机制，并为使用抗病毒干预措施提供信息。一项基因组水平的变异研究表明，单个宿主内新冠病毒的多样性可能被低估了（参考文献1）。

SARS-CoV-2变异肯定会出现在每个感染者身上，这些变异可能受到选择压力的影响，比如与刺突蛋白结合的抗体所施加的压力。常用的测序技术不能检测单个样本中的不同病毒变异株。为了解决这一限制，该论文的作者开发了一种高通量SGS (HT-SGS)策略，SGS即单基因组扩增和测序(single-genome amplification and sequencing），该方法能从大量单个病毒基因组中对表面蛋白基因区域进行长读数深度测序。该方法在概念上类似于常规的SGS程序，即在极限(limited)稀释的情况下放大单个分子用于Sanger测序。

将这种方法应用于体外传代的SARS-CoV-2临床分离株的对照毒株WA-1和7名COVID-19研究参与者的上呼吸道样本。结果表明，在急性感染期间SARS-CoV-2的基因变异株会在宿主的免疫压力下出现。SARS-CoV-2变异株在每个宿主中都会出现，并受到免疫选择压力的影响。

该技术揭示了SARS-CoV-2临床分离株经细胞培养后显示出广泛的遗传多样性。当这种方法用于分析患者分离物（含SARS-CoV-2）在Vero细胞中传4代后的产物时，在剌突、ORF3、包膜和M蛋白编码区域，共检测到18种独特的突变组合，构成18种单倍型（haplotypes），在剌突蛋白NH2末端结构域(NTD)和弗林蛋白酶（furin）裂解位点区域存在非同义突变的聚集。超过一半的单基因组序列与参考序列不同。许多变化可导致氨基酸替换，表明选择压力在细胞培养的适应过程中在发挥作用。

然后在发病8 - 17天时对7名患者进行宿主个体内病毒变异株检测，显示的多样性较低，仅检测到少量序列相同的单倍型。这些相对同质的序列可能是在感染早期抗体压力有限时取样的结果。检测纵向样本的抗体反应显示了增加和扩大的对刺突蛋白的抗体反应。对一个个体的纵向分析显示了4种病毒单倍型，在一个被自体抗体靶向的NTD穗状表位上有3个独立突变（参看下图）。与这些突变同时发生的是血清抗体与剌突结合能力6.2倍的上升和病毒负荷的短暂增加。

作者的结论是，SARS-CoV-2显示出一种快速的遗传适应能力，这种能力在体液免疫开始起作用时就可在体内检测到，这可能导致在疾病急性发作时延迟病毒的清除。

图：新冠病毒剌突蛋白抗原与抗体的相互作用。

NTD mutation：NH2末端结构域突变；epitope：表位（抗原决定簇）; Antibody：抗体。

针对抗体反应和个体基因组突变的研究显示，针对刺突蛋白N端片段抗体的出现、结合这些抗体区域的氨基酸变化和病毒清除延迟之间存在相关性。这些结果与感染期间导致SARS-CoV-2剌突变异的抗体压力一致(如上图所示)。SARS-CoV-2在单个宿主中的变异以前没有被描述过，可能是由于以前的测序方法无法区分变异和技术误差。也有可能高质量的数据是在病毒滴度高而抗体压力尚未出现的感染早期获得的。

随着血清与刺突蛋白结合能力的增加，可检测到多个SARS-CoV-2变种在单个表位上具有独立突变，以及病毒负荷的短暂增加。这些发现表明，SARS-CoV-2复制导致了足够的病毒遗传多样性，使免疫介导的变异在COVID-19急性感染期间就经受自然选择。从这些发现中可以得到一些重要信息。它们说明了单个宿主体内病毒株的多样性可能导致抗体抗性变异株的出现，如果产生的变异株有更高的适应性，它们可能更快地在种群中传播。在感染早期，通过先前的免疫或通过抗病毒治疗，在抗体选择发生之前，可通过限制病毒繁殖来避免病毒在宿主内逃逸。该研究方法应当更多地应用于COVID-19患者样本的研究，以了解宿主个体内SARS-CoV-2的潜在变异程度，这将有助于确定个体内SARS-CoV-2进化对COVID-19临床结果和抗病毒药物敏感性的影响程度。

参考文献：

1.  Ko SH, et al. (2021) High-throughput, single-copy sequencing reveals SARS-CoV-2 spike variants coincident with mounting humoral immunity during acute COVID-19. PLoS Pathog 17(4): e1009431. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009431