原名：Novel fecal biomarkers that precede clinical diagnosis of ulcerative colitis

译名：溃疡性结肠炎临床前诊断新的粪便生物标志物

期刊：Gastroenterology

IF：17.373

1、UC后受试者的微生物群组成不同于HC和UC前

分析了UC前、UC后和匹配的HC受试者粪便样本中的微生物组成（图1A）。基于16S rRNA基因测序的微生物β-多样性显示UC后分别与HC和前UC样本聚类（图1B）。与HC和UC前相比，UC后样本的α-多样性降低（图1C），Adlercreutzia的相对丰度降低（图1D）。与HC相比，UC后Actinobacillus相对丰度增加（图1D）和Bilophila相对丰度降低。

为了改进分类群的分类，并评估微生物群的功能基因组潜力，本文对个体子集（每组8名受试者；图2A）进行了鸟枪宏基因组学研究。除了观察到UC后双歧杆菌与HC相比减少（图2B），还确认了Adlercreutzia equalifaciens的减少，并确定了29个分类群，这些分类群仅在UC前样本中检测到，但在HC和UC后样本中未检测到。此外，与HC相比，UC前患者中Flavonifractorplautii, Coprococcus catus和 Parabacteroides merdae增多（图2B）。总之，这些数据表明，虽然UC前与HC相比可以检测到一些微生物差异，但已确定的疾病是与UC相关的微生物群变化的关键驱动力，因为成分变化在UC后最为明显。

图1 继续发展为UC（UC前）的高危受试者和未发生IBD（健康对照；HC）的匹配高危个体的粪便微生物群与UC诊断（UC后）个体的粪便微生物群不同。（A）粪便样本收集自继续发展为UC的高危受试者（UC前；n=13）和诊断时（UC后；n=9）。随访时没有提供四份UC后样本，另外两名UC后受试者的粪便中没有足够数量的16SrRNA基因测序。匹配的未发生IBD的高危受试者被用作HCs（n=48）。通过16S rRNA基因测序确定微生物群落组成。（B）利用Bray-Curtis和unweightedUniFrac距离度量，用PCoA说明HC、UC前和UC后样本粪便微生物群的β-多样性。（C）使用香农指数计算HC、UC前和UC后样本粪便微生物群落的α-多样性。（D）HC、UC前和UC后粪便样本中Adlercreutzia和Actinobacillus的相对丰度。每个点代表一个单独的患者样本和数据，以四分位间距和从最小值到最大值的虚线表示的中值。

图2 鸟枪测序宏基因组学确定了UC发病前粪便微生物群的组成变化。（A）显示UC发病前（UC前；n=8）微生物变化的树状图，与保持健康的匹配高危个体（HC；n=8）和UC后（n=8）粪便样本。（B）由鸟枪基因组学测定的Adlercreutzia equolifaciens, Parabacteroides merdae, Coprococcuscatus和 Flavonifractorplautii,的标准化丰度。每个点代表一个单独的样本，每个匹配的前、后UC样本用不同的颜色表示。没有匹配后UC样本的前UC样本表示为黑色圆圈。数据显示为中位数，四分位数范围和虚线从最小值扩展到最大值。LEfSe方法测定的类群间的统计学意义。

2、UC前微生物群的微生物功能发生改变

利用鸟枪宏基因组学对粪便样本进行功能分析，发现4条途径在UC前是唯一存在的，但在HC和UC后却不存在。与HC相比，UC前还具有较高的L-精氨酸生物合成（I，IV）、生物素生物合成II、tRNA和多胺生物合成的丰度。总的来说，UC前后共有15条途径，但在HC中未检测到，包括与氨基酸和蛋白质代谢相关的途径，如赖氨酸发酵为醋酸盐和丁酸盐、肌酐降解II、酮生成和蛋白质N-糖基化。粪便代谢组学分析还显示，与HC相比，UC前和UC后转羟脯氨酸增加的趋势，以及UC前后甘油和甘油磷脂的显著降低。

进一步的宏基因组数据分析发现，超过22000个细菌基因家族在UC前和HC之间以及UC前和UC后之间存在差异。其中，237个独特的基因家族（有一个或多个贡献的菌群）与蛋白酶或肽酶相关（图3）。此外，根据蛋白酶或肽酶相关基因家族，可将UC前的整体微生物功能与HC区分开来（图3）。综合起来，这些数据揭示了临床UC诊断前与蛋白质和氨基酸代谢相关的微生物组成和功能改变。

图3 与蛋白酶和肽酶相关的基因家族的热图在选定的健康对照组（HC；n=8）和UC前（n=8）样本之间发生显著变化，如鸟枪宏基因组学所分析的。采用Euclidean距离和average linkage clustering聚类法进行层次聚类。

3、溃疡性结肠炎前期粪便蛋白水解活性增强，并含有细菌成分

在酶水平上，UC前微生物基因组潜力的差异也存在。与HC样本相比，UC前的蛋白水解酶和胰肽酶活性更高，达到UC后样本中观察到的类似水平（图4A）。在一组活动期UC和CD患者中验证了我们的研究结果，证实了在粪便排泄量中与对照验证受试者相比的蛋白水解活性较高。

为了研究微生物对蛋白水解特征的贡献，本文首先将胰肽酶活性与HC和UC前期受试者的细菌分类群相关联。胰肽酶与活性UC中发现较低的细菌类群（如Adlercreutzia）和其他有益细菌（如Akkermansia）呈负相关（图4B）。HC和UC前的胰肽酶活性也与Bacteroides vulgatus的相对丰度呈正相关（图4C），这是一个已知的具有高蛋白水解活性的分类群。此外，本文发现UC前B. vulgatus的蛋白酶与HC相比有所增加（图3）。宏基因组学还发现，在前UC分类群中，蛋白酶基因家族的增加，如P.merdae和C.catus，其在前UC中的丰度高于HC（图3）。为了进一步支持这一点，本文从患者粪便样本中分离出蛋白水解细菌。无论诊断或疾病状态如何，所有患者都存在具有蛋白水解活性的细菌，但鉴定出的菌株依赖于供体。本文确认了不同的细菌，包括Bacteroides，具有较胰肽酶高活性。事实上，显示蛋白水解活性的Bacteroides包括与胰肽酶活性相关的Bacteroides vulgatus（图4C）。

图4 功能性粪便蛋白水解差异在UC诊断前被检测到。（A）在UC诊断前（UC前；n =13）和UC诊断后（UC后；n =9）以及匹配的HC（n =48）的粪便样品中测定总蛋白水解活性和胰肽酶活性。每个匹配的前、后UC样本用不同的颜色表示。没有匹配后UC样本的前UC样本表示为黑色圆圈。（B，C）用16S rRNA基因谱分析法测定了HC和UC前胰肽酶活性与（B）Adlercreutzia、Akkermansia和（C）Bacteroides vulgatus相对丰度的相关性。每个点代表一个个体参与者的样本和数据，显示为中间值，四分位间距和胡须从最小值延伸到最大值。

4、UC前蛋白水解表型和炎症免疫调节转移到了gnotobitic小鼠

本文假设UC前肠道微生物蛋白水解活性的变化代表了微生物源性蛋白酶参与炎症自发发病的机制。为了验证这一点，首先用5名UC患者的粪便样本（包括前、后样本）和匹配的HC将成年GF小鼠定植。蛋白水解表型将UC前后的粪便转移到有UC前和UC后微生物群的GF小鼠中（图5A和B）。与先前的研究一致，溃疡性结肠炎后的微生物群导致炎症性免疫反应，在定植小鼠中结肠PMN细胞增多（图5C）。最重要的是，UC前菌群在定植小鼠中复制了蛋白水解表型，并导致结肠出现炎症性免疫反应（图5C）。

由于成年GF小鼠与出生后定植的小鼠在功能和免疫方面存在差异，本文开发了一个gnotobiotic定殖模型，即用UC前、后供体的粪便和从先前实验中选择的匹配HC进行定植。幼崽从出生时就以这种方式自然定植，并纵向跟踪12周（图5D）。粪便功能分析显示，在8周龄和12周龄时，从接种有UC前后菌群的母鼠出生的小鼠的整体蛋白水解活性高于HC定殖的小鼠（图5E），这表明UC前供者样本的蛋白水解表型也可转移至新生定殖小鼠。尽管没有动物出现自发性结肠炎，但与HC定植小鼠相比，UC定植前和UC定植后小鼠结肠粘膜中出生的动物表现出更高的PMN细胞计数，类似于成年定植小鼠中观察到的情况（图5F）。在4周龄和12周龄时，与HC定植小鼠相比，从UC定植前母鼠出生的小鼠的肠道炎症标志物、粪便脂质钙蛋白水平也较高，达到与UC定植后小鼠相似的水平。在12周时，通过全结肠组织基因显示，与HC相比，来自UC前定殖母鼠的40个与先天免疫和凋亡相关的基因存在差异。Il18、Il1、Stat2和Irf1的表达较低，而基因表达与细菌识别和先天性有关，与HC相比，UC前定殖母鼠所生小鼠的免疫功能（如Tlr2、Tlr5、Nod2和Il1b）更高。在UC前定植的母鼠与HC小鼠的结肠组织中，5种生物网络发生了改变。排名第一的网络涉及免疫疾病、抗菌药物和炎症反应。在典型途径中，UC前定植后代的过度表达基因与NFKB信号、细菌和病毒的模式识别受体的作用、p38 MAPK信号和急性期反应信号有关

在4周龄、8周龄和12周龄时，子代的粪便微生物组群与其母亲的粪便微生物组相聚集，且UC前、后定植小鼠的α-多样性均低于HC定殖小鼠（图6B）。出生于母鼠的小鼠，在UC前和UC后的微生物群中，类杆菌的丰度较高，放线杆菌的丰度较低（图6C）。在属水平上，与HC相比，UC前定植的母鼠出生的小鼠中检测到类杆菌增多，UC前和后定植小鼠中Adlercreutzia和Akkermansia与HC相比减少（图6C）。与人类队列中的发现类似，HC和UC前定殖小鼠的蛋白水解活性与Adlercreutzia和Akkermansia的相对丰度呈负相关（图6D），与类杆菌直接相关（图6D）。

利用五种不同的人类供体和两种不同的定植模型，发现UC前微生物群增加了粪便蛋白水解活性，这与宿主炎症反应和低度炎症相关的网络和途径的激活相一致。这一结果支持了这样一种观点，即UC前微生物群足以通过其蛋白水解活性在小鼠体内诱导低级别炎症状态。

图5 UC前期蛋白水解表型和炎性免疫张力转移到定植小鼠。（A）选择五位提供完整样本（UC诊断前后）的UC捐献者，以及每个UC患者的一个匹配对照。每个粪便样本经口灌胃给n=3-5 8-12周龄无菌（GF）C57BL/6雄性和雌性3周。（B）成年小鼠粪便蛋白水解活性、胰肽酶活性和（C）结肠多形核细胞（PMN）计数。（D）将妊娠无菌（GF）小鼠与一个选定的UC供体定植，该供体提供UC前后的样本或匹配的HC。从出生后第1周采集母鼠粪便样本。每周评估后代的体重变化，每周收集粪便样本。（E）来自HC、UC前或UC后微生物群的母鼠后代的粪便总蛋白水解活性、胰肽酶活性和（F）结肠PMN细胞计数。每个点代表一个单独的鼠标，每个颜色代表不同的匹配的UC前后样本（填充点）或匹配的HC（开放点）。

图6 新生定植小鼠的微生物群与定殖dam聚集在一起，并与蛋白水解活性相关。（A）利用加权和未加权的UniFrac和Bray-Curtis不同距离度量，以PCoA为例说明了HC、前UC或后UC微生物群的母鼠粪便微生物群的β-多样性。（B） 使用香农指数计算的HC、UC前和UC后样本粪便微生物群落的α-多样性。（C）拟杆菌、放线杆菌和Adlercreutzia的相对丰度HC在UC前和UC后殖民母鼠的后代中。（D）利用16S rRNA谱分析数据，测定了HC和UC前感染母鼠后代胰肽酶活性与Adlercreutzia、Akkermansia和类杆菌相对丰度的相关性。每个点代表一个单独的鼠标，数据显示为中间值，四分位间距和虚线从最小值扩展到最大值。

本文发现，在一部分UC患者中，在临床诊断之前便存在粪便蛋白水解活性增加的现象。与先前的研究一致，在这一前瞻性队列研究中，发现活动性UC患者的肠道菌群组成发生了变化，有益细菌类群（如Adlercreutzia和双歧杆菌）的多样性和丰度较低，而病原体（如放线杆菌）丰度较高，这可能是炎症和损伤的结果。活动性IBD的蛋白水解失衡以前已有报道，但在临床发病前是否存在这种失衡以及潜在的微生物作用尚不清楚。这里研究的独特队列，结合微生物群人源化的gnotobiotic模型，使本文能够研究UC临床诊断前存在的微生物源性功能变化，最终可作为早期干预的目标。

研究结果表明，微生物对疾病前的蛋白水解特征有贡献。肠道细菌产生大量蛋白酶，有可能影响宿主的免疫和功能途径，导致功能失调时的促炎症反应。例如，机会性肠道病原体使用蛋白酶作为毒力因子。宏基因组分析表明，在UC的临床诊断之前，有一个微生物功能谱图，它具有增强的蛋白质代谢，以及先前与IBD相关的氨基酸代谢。前UC和HC受试者改变了细菌基因家族的表达与蛋白酶有关。此外，基于蛋白酶相关基因家族，前UC微生物功能谱可与HC区分，进一步支持微生物群对这种蛋白水解特征的贡献。粪便胰肽酶活性与Bacteroides vulgatus呈正相关，在体外证实了该组细菌分离株具有较高的蛋白水解和胰肽酶活性。在通过鸟枪宏基因组学鉴定的与HC和UC前患者不同的蛋白酶和胰肽酶相关的基因家族中，有几个与来自B. vulgatus的肽酶相关的基因，包括ATP依赖的Clp蛋白酶蛋白水解亚基和肽酶s24家族蛋白。此外，与HC患者相比，UC前期患者中增加的其他蛋白酶和肽酶基因家族来自于蛋白水解类群，其丰度高于HC患者，如对聚β-内酰胺类。

蛋白水解活性也与Adlercreutzia和Akkermansia的丰度呈负相关，这些类群具有抗菌和抗炎特性，并且在活动性IBD患者中显示为耗尽。Adlercreutzia是一个代谢异黄酮的属，异黄酮是一种酚类化合物，以其抗菌和抗炎作用而闻名，其在UC中的减少可能促进炎症状态。蛋白水解活性与已知抗炎特性的细菌在活动性疾病中降低之间的负相关表明粪便蛋白水解活性可作为疾病进展或活化的标志物。

最后，通过成人和新生儿定植模型，使用不同的UC样本，将糖尿病前期蛋白水解酶表型转移到小鼠身上。与人类样本中观察到的相似，HC和UC前定殖小鼠的蛋白水解活性与类杆菌呈正相关，与Adlercreutzia和Akkermansia呈负相关，进一步支持微生物对提高蛋白水解活性的贡献。以前在用活跃的IBD微生物群定殖的小鼠模型中已经描述过增强免疫张力的诱导。本文证明，被UC前菌群定殖的小鼠在结肠中也会产生炎症信号，这与定植时的年龄无关。这一特征表明，除了作为早期疾病进展的潜在生物标志物外，在疾病临床诊断之前观察到的蛋白水解活性的增加也可能驱动炎症和疾病进展。

虽然对IBD患者的微生物功能特性进行纵向研究有助于了解疾病随时间的推移而发展，疾病前期状态，以揭示疾病的发病机制和病因。另一方面，考虑到UC的自然发病率，本文的研究受到患者数量少的限制。未来的研究对于证实这些结果以及研究其在克罗恩病患者中的作用将是重要的。此外，参与者没有提供几个UC后样本，导致配对数据分析不可行。增加UC前后配对数据的数量，将有助于更好地分析疾病发生前后的额外微生物差异。尽管如此，本文证明，在IBD高危人群中，与蛋白水解酶活性相关的微生物功能的差异在临床相关疾病发生之前是明显的，这是发展UC的进展。所识别的途径可能导致新的非侵入性生物标记物测试，以监测高危人群，以及针对具有高蛋白水解酶活性的患者群体使用特定的人类或细菌抗蛋白酶进行特定治疗。