原名：Three Novel Dietary Phenolic Compounds from Pickled Raphanus Sativus L. Inhibit Lipid Accumulationin Obese Mice by Modulating the Gut Microbiota Composition

译名：腌制萝卜中三种新的膳食酚类化合物通过调节肠道微生物组成抑制肥胖小鼠的脂肪积累

期刊：Molecular Nutrition Food Research

IF：5.309

发表时间：2021.2

通讯作者：张玲玉 & Hui‐Min David Wang

通讯作者单位：集美大学食品与生物工程学院&福建省海洋功能食品工程技术研究中心

对腌制萝卜中提取的DHAP、4-HPEA和HBA进行了分离鉴定。三种酚类化合物的结构如图1所示。

图1 三种酚类化合物的结构。

LO2细胞的培养基是含有10%胎牛血清和1%抗生素（链霉素和青霉素）的DMEM高葡萄糖，然后细胞在37℃，5%的CO2中培养。培养基每2天更换一次。用MTT法测定LO2细胞的活力。油红O染色法测定细胞内总脂质含量。细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量用酶试剂盒测定。

小鼠保持在恒定的湿度（65±15%）和温度（23±2℃）下的无病原体条件下饲养，并进行12小时的光照/黑暗循环。通过口服灌胃法给动物使用多酚。适应性喂养7天后，将小鼠随机分为以下6组（每组6只）：

A：NC组（对照组）：小鼠接受正常饮食；

B：HFD组：小鼠接受高脂饮食（DIO系列饮食，60% H10060）；

C：DHAP组：小鼠接受HFD加DHAP（7 mg/kg体重）;

D：HPEA组：小鼠接受HFD加4-HPEA（130 mg/kg体重）；

E：HBA组：小鼠接受HFD加HBA（300 mg/kg体重）；

F：SV组（阳性组）：小鼠接受HFD加SV（5 mg/kg体重）

每周测量体重和食物摄入量。喂食8周后，小鼠在禁食12小时后安乐死。粪便样本是从结肠收集的。

采用酶促试剂盒检测血清TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。计算出动脉粥样硬化指数（AI）和冠状动脉风险指数（CRI）。

通过使用TIANamp细菌DNA试剂盒从粪便样品中提取总细菌DNA。细菌16s rDNA的V3和V4区用341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）引物扩增。按照PE-250bp测序方案对纯化的扩增产物进行测序。然后进行生物信息学分析。

1 DHAP、4-HPEA和HBA对LO2细胞的细胞毒作用

用MTT法分析细胞活力。高浓度的DHAP（1.3和2.6mM）和HBA（3.3和6.6mM）处理显著降低了LO2细胞的活力（图2）。检测不同浓度的DHAP、4-HPEA和HBA对经游离脂肪酸处理细胞的细胞活力的影响。最高浓度的DHAP（2.6mM）和HBA（6.6mM）显著降低了经游离脂肪酸处理的细胞的活力，而仅用游离脂肪酸处理的细胞活力增强。

图2 三种化合物对LO2细胞NAFLD模型的影响。用不同浓度的三种酚类化合物单独处理LO2细胞24小时（A）或与游离脂肪酸联合处理24小时（B）后，用MTT法测定细胞活力。

2 DHAP、4-HPEA和HBA可减轻游离脂肪酸诱导的LO2细胞脂质积累

用游离脂肪酸处理LO2细胞24小时后建立肝脂肪变性的体外模型。DHAP、4-HPEA和HBA预处理对游离脂肪酸处理LO2细胞脂质积累的影响如图3所示。DHAP、4-HPEA和HBA显著抑制细胞脂质积累，高剂量HBA的作用强于低剂量。最高剂量的4-HPEA（7 mM）和HBA（3.3 mM）显著抑制细胞活性。此外，DHAP预处理（1.3 mM）降低TG水平。结果表明，从腌制萝卜中提取的三种化合物（DHAP、4-HPEA和HBA）在体外具有抗肥胖的作用。

图3 用油红O染色法过程游离脂肪酸诱导24小时后细胞内脂质积累。显微镜下观察LO2细胞内的脂滴（400倍）：正常对照组（A），仅用0.6 Mm游离脂肪酸处理组（B），SV组为阳性对照组，经SV预处理（C），用不同浓度的DHAP（0.325和1.3 mM）（D，D’），4-HPEA（0.07和7 mM）（E，E’）和HBA（0.8和3.3 mM）（F，F’）预处理细胞24小时，再用0.6 mM游离脂肪酸诱导24小时后。细胞内脂质积累的半定量描述（G）。DHAP、4-HPEA和HBA对LO2细胞TG和TC含量的影响（H，I）。

3 DHAP、4-HPEA和HBA抑制HFD肥胖小鼠的肥胖发展

使用HFD诱导的小鼠肥胖在体内检测DHAP、4-HPEA和HBA对肥胖的影响。如图4所示，从第二周开始，HFD组的体重明显高于正常对照组。虽然五个高脂肪饮食饲养组之间没有显著差异，但与HFD组相比，SV、DHAP、4-HPEA和HBA组有降低增重的趋势。

图4 三种酚类化合物对体重增加（A）HFD，高脂饮食；SV，辛伐他汀；DHAP，2，6-二羟基苯乙酮；4-HPEA，4-羟基苯乙醇；HBA，4-羟基苯甲醛对体重增加的影响（B）。

4 DHAP、4-HPEA和HBA降低肥胖小鼠血脂水平

研究了DHAP、4-HPEA和HBA对小鼠血脂水平的影响。与NC组相比，HFD组小鼠血清TC和LDL-C水平升高（图5A）。DHAP组、4-HPEA组和HBA的血清TG和LDL-C水平明显低于HFD组。此外，三酚类化合物组与SV组血清TG和LDL-C水平无显著差异。与HFD组相比，HBA组的HDL-C水平更高。DHAP组、4-HPEA组、HBA组和SV组的动脉粥样硬化指数（AI）、冠状动脉危险指数（CRI）均显著低于HFD组。

图5 三种酚类化合物对高脂小鼠血脂的影响。血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）（A）、动脉粥样硬化指数（AI）（B）、冠状动脉危险指数（CRI）（C）。

5 DHAP、4-HPEA和HBA对肥胖小鼠肠道菌群的影响

图6A所示的Alpha多样性分析结果显示，HFD饲养改变了小鼠的物种丰富度和肠道菌群组成。各组间的肠道微生物群多样性无显著差异（图6A）。此外，基于加权和未加权的均匀距离度量，PCoA显示了不同组间肠道微生物群落的概况（图6B）。如图6B所示，高脂饲料和标准饲料喂养的小鼠表现出不同的微生物群结构。具体来说，HBA组的微生物群分布与HFD组的微生物群分布明显不同。这些结果与图6C所示的UPGMA的结果一致。

厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）被认为是肠道微生物群中的优势种。与HFD组相比，SV组和DHAP组的厚壁菌门相对丰度较低。SV、DHAP和HBA组的拟杆菌门相对丰度高于HFD组。厚壁菌门与拟杆菌门的比例是判断肠道微生物群变化的关键指标。HFD组的厚壁菌门与拟杆菌门比例主要高于NC组（图6D）。除4-HPEA组外，所有实验组的厚壁菌门与拟杆菌门比值均低于HFD组。此外，图6E还揭示了在HFD饲养条件下，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度更高。HBA导致变形菌门相对丰度降低，而与HBA组、DHAP组相比，变形菌门比例无显著差异。属水平的物种多样性分析表明，各组之间属的相对丰度存在差异（图6E）。

图6 三种酚类化合物对肠道微生物群组成的影响。Alpha多样性分析，包括ACE、Simpson和Shannon指数（A）。PCoA分析基于β多样性，使用加权均匀距离（B）。肠道微生物群的UPGMA聚类（C）。肠道微生物群门（D）和属（E）水平的细菌分类学水平。

线性判别分析效应量（LEfSe）用于不同组之间成对比较的生物标志物发现。LEfSe分析揭示了HFD小鼠和正常小鼠之间存在很强的微生物组差异（图7A）。此外，在三种酚类化合物中，HBA对HFD组细菌类群相对丰度的影响最大（图7B）。

图7 采用LEfSe分析HFD组与NC组（A）和HBA组（B）肠道长寿差异。数据以分支图的形式显示分类结构和相对丰度，线性判别分析（LDA）评分分布条形图的形式显示类群间存在统计差异的物种。给出了LDA评分大于4的分类群。

DHAP、4-HPEA和HBA处理显著降低处理显著降低了经游离脂肪酸处理的LO2细胞中的脂质积累。这些结果在HFD诱导肥胖小鼠模型的体内得到验证。本研究分析了小鼠模型中的肠道微生物群，以揭示DHAP、4-HPEA和HBA对肥胖的影响。

肝细胞中过度的脂质积累是NAFLD的标志。在一定浓度范围内，用DHAP、4-HPEA和HBA处理可降低游离脂肪酸诱导的TG含量的增加，HBA和4-HPEA处理可降低细胞内TC水平。DHAP、4-HPEA和HBA有可能在体外预防NAFLD中的脂质积累。细胞内脂质增加可能与脂肪酸氧化引起的脂质过氧化应激有关。因此，这三种酚类化合物可能通过引发抗氧化作用而降低了细胞TG水平。

动物实验进一步证实，DHAP、4-HPEA和HBA有效地减轻了HFD诱导的小鼠的高脂血症症状，包括改善体重增加和血脂水平。HBA组HDL-C显著增加，TC水平有增加的趋势。TC水平是血脂蛋白中所有脂类的总和。总胆固醇水平是血液脂蛋白中所有脂质的总和。基于HBA组同时存在LDL-C和TG水平降低的假设，TC水平升高（虽然不显著）可能与HBA组HDL-C水平升高有关。

膳食摄入的总多酚的大约90-95%可能积累在大肠腔中，在那里它们被肠道微生物酶消化。微生物群的组成也可能受到多酚的影响。因此，饮食中的多酚通过与肠道微生物群的相互作用影响宿主的健康微生物多样性包括α多样性和β多样性，是肥胖发育过程中重要的生物标志物，肥胖宿主的肠道菌群多样性和丰富度低于瘦宿主。三种酚类化合物对肥胖小鼠肠道细菌多样性和丰富度略有增加，但对肠道微生物α多样性的影响有限。

PCoA用来表征不同的肠道微生物群。HFD组的肠道微生物群与DHAP组、4-HEPA组和HBA组明显不同。这说明三种酚类化合物对肠道微生物群结构有不同程度的影响。肥胖小鼠的F/B比增加，能量消耗增加。SV、DHAP和HBA组中拟杆菌门的相对丰度增加，与肥胖呈负相关。

在本研究中，物种多样性分析显示，7个细菌属与高脂肪饮食密切相关。基于LEfSe分析，鉴定出Mucispirillum和Lachnospiraceae。HFD组Mucispirillum的相对丰度高于DHAP组、4-HPEA组和HBA组。此外，与对照组相比，患有脂肪变性或NASH的个体表现出Ruminococcus的高丰度。与HFD组相比，HBA组Ruminococcus相对丰度较低。在本研究中，Odoribacter的丰度在HFD组下降，而在DHAP和4-HEPA组显著增加。HFD饲养小鼠的Helicobacter的相对丰度增加，三种酚类化合物的添加降低了Helicobacter的相对丰度。在LEfSe分析中，与HFD组相比，HBA组三种酚类化合物的肠道菌群差异最大。

近年来，人们对从天然产物中提取的生物活性化合物减轻体重的能力越来越感兴趣。本研究首次报道了从腌制萝卜中提取的三种酚类化合物在FFA诱导的NAFLD细胞模型中可以抑制脂质积累。这项研究有几个局限性，首先，目前的研究只关注特定营养元素的生物活性，而没有研究腌制萝卜整体的营养。其次，这三种化合物对人体给药的有效浓度值得进一步探索。第三，没有提供肠道微生物群的改变与脂质水平变化之间的直接证据。需要进一步的研究来探索这些变化和肠道微生物群之间真正的因果关系，而不是描述性的微生物群普查分析。此外，体外实验结果显示，DHAP、4-HPEA和HBA的降脂作用可能存在替代机制。总之，本研究表明，从腌制萝卜中提取的酚类化合物抑制经游离脂肪酸处理的LO2细胞和HFD诱导的肥胖小鼠的脂质积累。DHAP、4-HPEA和HBA的降脂作用部分是由肠道微生物群组成的改变介导的。这些发现表明腌制萝卜中酚类化合物是开发营养和功能食品的一个潜在来源。