编译：独世，编辑：小菌菌、江舜尧。

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1 基于时间分辨的宏基因组学

质控后，每个样本中MG和MT读数的平均值分别为5.3×107（±7.7×106）和3.3×107（±1.2×107）。我们进行了特定于样品的基因组组装（每个样品平均4.1×105个重叠群），然后进行binning处理，总共产生了1364个符合质量标准的MAG。为了追踪随时间变化的单个微生物种群的丰度，基因表达和活性，我们在样品中重复复制了MAG，从而生了成220个代表性MAG（rMAG）。我们从中进一步选择了78个具有最高完整性的rMAG（平均完整性为76.2％，平均污染为2.2％）。这些基因组代表了整个时间序列的主要种群，每个时间点的总MG读数和MT总读数的平均映射百分比分别为26％±3％（sd）和27％±3％（sd），先前基于16S rRNA扩增子测序的研究证实了这一点。关于MP测定，我们获得的每个样本平均值为1.5×10⁵±8.2×10³（sd）MS2光谱，总共为7.6×10⁶MS2光谱。在7.8×10⁵个已经鉴定的肽中，有3.3×10⁵（43％）个肽可以与78个rMAGS的2.1×10⁵个预测的编码序列匹配。每个时间点平均可进行1.5×10⁴±4.5×10³（sd）次光谱匹配，即所有与rMAG相关的匹配中，将其中平均94％分配给具有预测功能的基因，即分配给KEGG直系同源基因组（KOs）。为了研究整个群落的资源空间和代谢物周转率，我们使用气相色谱（GC）结合质谱（MS）的非靶向方法测量了代谢物水平。鉴定出的代谢物中共有89％（65个中的58个）与rMAGs编码的酶相关。我们通过计算两个馏分中检测到的42种代谢物的细胞内代谢物与细胞外代谢物的比率来估算资源吸收。此外，在采样过程中测量了六个非生物参数，并连续记录了34个参数，作为BWWTP在线监测的一部分。

非原位实验生成了MG和MT数据。实验模拟了BWWTP内的波动条件，即在溶解氧变化的条件下群落对油酸流入产生的脉冲扰动的短期响应。在添加油酸后的0、5和8 h对获得的DNA和RNA进行了测序，每个样品平均获得1.02×10⁸ MG和9.33×10⁷MT的读数。与原位实验样品序列相比，增加的测序深度对于理解群落对油酸的短期响应非常重要。将测序读段映射到选定的rMAGs数据集揭示了与原位时间序列相当的映射百分比（对于MG读段和MT读段，21％±1％）。

总体而言，我们的宏组学数据集全面描述了BWWTP中脂质积累过程的混合微生物群落，尤其是其功能潜力、组成、活性以及底物的可利用性和同化作用。

2 不同的生态位类型

为了通过功能基因组潜力解决相关细菌种群的基本生态位，我们将KO分配给了rMAG的预测编码序列。我们假设个体群体将基于其功能潜力的相似性/不相似性而形成聚类。基于成对Jaccard距离，我们发现了四个不同的rMAG聚类（图2a）。这些功能聚类（FunC）代表了rMAG已知整体代谢能力的差异，并反映了它们的基本生态位。FunC-1包含了放线菌，FunC-2的主要成分是拟杆菌门，这其中主要是鞘脂杆菌纲（图2a）。FunC-3包含β-变形菌纲和γ-变形菌纲，而FunC-4似乎更多样化，包含螺旋藻属亚群，δ-变形菌纲和分类学上未分类的rMAGs。我们发现基于污泥的基因组距离与FunC分配密切相关（PROCRUSTES平方和：0.399，相关系数0.775，PROTESTp=0.001），强调了系统发育是FunC分配的重要决定因素。然而，一些远距离链接的亚群是由它们共享的功能互补定义的，即在相应的系统树中，它们被分配给与其邻居不同的FunC。这表明除系统发育的方法外，基于KO配置的相似度分析还提供了重要信息。

所有FunC之间共享了1857个KO，研究发现FunC 1、3和4存在相当数量的非冗余KO，分别为4276、4177和4129（图2b）。FunC-2的KO数量（3550）下降，同时它也代表了分类学上最少的FunC，几乎由束缚杆菌属和噬几丁质菌组成。我们测试了单个FunC中的分子功能，发现脂质代谢功能显著富集在FunC-1，氨基糖和核苷酸糖代谢功能富集在FunC-2以及生物膜和分泌系统有关的功能富集在FunC-3（图2c和补充数据5；Fisher检验，调整后的p值<0.05）。

虽然积累脂质的生物体具有回收高价值分子的巨大潜力，但这些生物体之间以及整个群落之间的相互作用在原位还没有得到充分的研究。研究发现，FunC-1的24个rMAGs中有23个编码了参与脂质存储的二酰基甘油O-酰基转移酶（DGAT/WS），表明TAG积累在该聚类中的重要性。大多数FunC-3成员还编码DGAT/WS（19个中的14个）。此外，PHA合酶富集在FunC-3（19个中的15个）。所有rMAGs均编码脂肪酶，参与脂肪酸合成或β-氧化的功能。但是，几种酰基CoA和酰基ACP脱氢酶的含量在FunC-1和FunC-3中过高。另外，参与脂肪酸降解和生物合成的乙酰辅酶A乙酰转移酶在所有FunC中普遍存在。参与脂质积累的基因在FunC-1和FunC-3中的富集与先前的代谢特征一致，其中FunC-1主要由放线菌门组成，先前报道指出了它的成员具有积累TAG的功能。FunC-3包含β-变形杆菌和γ-变形杆菌，研究指出这些类群可以积累TAG、WE和/或PHA，例如陶厄氏菌、Albidiferax spp.或放线菌。重要的是，研究发现这些FunC之间在利用乙酰辅酶A存在一定的差异。具体而言，FunC-1成员显示出与乙基丙二酰-辅酶A代谢途径相关的功能丰富（巴豆酰-辅酶A还原酶和烯酰ACP还原酶），而FunC-3成员编码参与乙醛酸循环的关键酶（苹果酸合酶和异柠檬酸裂合酶）。

研究进一步确定了四个FunC中富集的特定功能，涉及其他大分子（包括碳水化合物酶和蛋白酶）的分解，氮循环，应激反应和运动性。判别性功能指出不同FunC之间存在相互依赖性，例如在反硝化方面（图2c）。结果发现分类学上一致的基团中出现分离现象会伴随着特定的保守功能，例如放线菌属特征性WhiB转录调节子在FunC-1中大量富集。总之，本研究在泡沫污泥微生物群中观察到一组广泛分布的核心功能集，并确定了具有脂质代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及生物膜和分泌系统的独特潜在功能的类群。

图2 基础生态位类型。a每个rMAG的功能库（存在KEGG直系同源基团[KO]）基于Jaccard距离的多维标度分析（MDS）。椭圆包含95％（内部）或99％（外部）的聚类分配的数据点，产生了四个不同的功能群集（FunC）。颜色表示rMAG的纲水平分类。b FunC之间共享和特有的的KO分配数。彩色条形图显示了单个FunC中非冗余KO分配的总数。中间的黑条表示不同组的FunC之间的重叠部分及其特有的KOs，下面的点定义了各个组的成员。c四个FunC中存在关键功能。代谢转化旁边的条形图显示了根据平均rMAG完整性进行调整的相应反应或途径的编码特征酶的rMAG的比例。rMAG中普遍存在的通路以灰色显示。

3 群落动态与稳定性

为了了解种群动态是否与底物可用性及其他非生物因素有关，我们使用MG的覆盖深度来推断整个时间序列中rMAG种群的丰度。我们计算了rMAGs丰度分布之间的距离（基于它们的成对相关性），发现rMAGs的动力学可以部分由FunC分配解释（PERMANOVA R² = 0.12，Pr> F = 0.002；分散度无显著差异），从而将FunC成员与时间丰度变化相关联。最丰富的分类单元包括微丝菌属（整个时间序列中相对丰度为26.0％）、不动杆菌（8.1％）、束缚杆菌属（8.0％）、间孢囊菌（7.2％）、钩端螺旋体（6.3％），Albidiferax（5.7％）和脱氯单胞菌属（2.4％）（图3a）。根据MiDAS田野指南数据库中的活性污泥中的微生物，其中一些回收的rMAGs属于丝状类群，例如高度丰富的微丝菌属和束缚杆菌属以及丰度较少的厌氧绳菌（1.1％）和戈登氏菌（0.2％）。

污水处理厂运行期间的变化主要是由于进水废水成分和气候条件的变化。我们观察到随着季节的变化，群落结构逐渐变化（图3a）。2011年10月（时间序列的第7个月），群落组成开始发生变化，2011年11月下旬，组成发生了明显变化。这种变化的特征是钩端螺旋体（在2011-11-23达到峰值）和不动杆菌（在2011-11-29达到峰值）的相对丰度（图3a），同时底物发生了明显的变化（图4）。底物主要包括非极性代谢物，包括长链脂肪酸（LCFA）和甘油酯，以及极性代谢物甘露糖、葡萄糖、二糖、乙醇胺和腐胺。结果发现，基于MG丰度的样本间距离部分由非生物因素的子集来解释（图3c）。夏季样品的特点是温度、磷酸盐水平较高，且细胞内油酸与细胞外油酸的比例较高。较高的细胞外甘露糖水平和电导率略有增加意味着秋季转变的开始。在11月期间，LCFA的细胞内和细胞外水平增加，表明LCFA的可用性或周转率更高，但未必等效转换为中性储脂。在随后的冬季时间点，底物水平恢复正常，群落转变回扰动前的状态。

考虑到微丝菌每天的原位生长速率大约为0.12-0.3个生长周期，它可以在大约十代内重新建立优势。与排除各个时间点的稳定性（平均种群稳定性：2.39±1.28；2011-11-02至2011-11-29）相比，单个rMAG的稳定性受到11月转变的严重影响（平均种群稳定性：1.43±0.69）。研究群落动态的结果表明群落组成是有弹性的，即在可用底物发生明显变化后恢复，且可以抵抗随时间的小规模环境波动。

虽然MG深度被用作种群数量的替代指标，但MT深度却可以分析群落内和单个种群的转录活性（图3b）。基于平均相对MT深度的样本间距离与基于MG的结果相似（图3c），尽管样本间距离增加表明群落变异性更高（图3d）。2011年4月和2012年4月收集的样本可能代表了季节之间的过渡状态。此外，2011年冬末和2012年的初春样本在表达水平上和丰度水平上非常相似。有趣的是，诸如微丝菌或噬几丁质菌之类的单个属的高丰度并不一定反映在其平均表达水平上（图3b）：钩端螺旋体，螺旋杆菌，厌氧菌和不动杆菌的种群其平均表达水平较高。不动杆菌rMAGs的相对MT深度增加（图3b; 2011-04-14、2011-05-08和2012-04-25）表明这些时间点附近的活性增加，但这并没有导致群落结构的变化。值得注意的是，不动杆菌较高的表达水平是通过增加杆状杆菌（2011-04-14至2011-05-20）或厌氧杆菌（2011-05-08至2011-09-19）的表达水平来实现的。与基于MG的稳定性值相比，基于MT的稳定性值基本上很少受群落转移的影响。本文指出了代谢途径活性对环境条件的适应性（图5）。从戊糖到EMP途径的中间体在MT和MP丰度之间表现出最高的相关性，其次是氢代谢和脂肪酸氧化。在11月的转变期间，一些途径表现出特征性的下降，例如氢代谢，碳氢化合物降解和TCA循环，而脂肪酸氧化则表现出明显的峰值。这表现出占主导地位的通才、脂质积累种群过渡为脂解群落。

每一个FunC中都包含编码相似的KO和代谢能力的多种生物，因此，我们研究了个体种群如何适应其环境。我们将群落结构和个体种群表达水平的变化与环境参数的影响联系起来。尽管rMAG的丰度模式可以与FunC分配相关联，但是当将rMAG的丰度与非生物因子相关时，我们无法识别出类似的分类。相反，相关模式表明在不同的FunC中部分rMAG出现了对环境条件的相似偏好。这表明具有类似基本生态位类型的种群对环境功能的反应不同，后者指向功能可塑性和对实际生态位的适应。

图3 群落结构和功能动态。a, b rMAGs随时间分别基于覆盖的MG深度（a）和MT深度（b）表示的相对种群的相对丰度和表达水平，分别代表MG [26％±3％（sd）]和MT [27％±3％（sd）]。单个rMAG的相对丰度根据属水平分类法进行分组，未分类的rMAG分配在“Other”中。平均丰度低于2％的恢复属归为一个单独的组（浅灰色）。c, d 基于Bray-Curtis非相似性排序图。受选定非生物因素（代谢物水平，代谢物比率和理化参数显示为黑色箭头，箭头长度表示环境指数，可作为每个因子的预测指标）限制的单个rMAG的相对丰度MG（c）和MT（d）

图4 代谢水平和理化参数。Z score随时间尺度上的代谢物强度，代谢物比率和理化参数水平变化而变化。行注释代表代谢物和参数的分类，测量类型（bnp：细胞内非极性代谢物，bp：细胞内极性代谢物，pcparams：理化参数，比率：代谢物内部/外部比率，snp：细胞外非极性代谢物质，sp ：细胞外极性代谢物质），以及测量方法（手动：在采样期间进行测量，在线：在WWTP操作期间进行测量）。

图5 随时间推移的基因水平按功能类别分组。rMAG衍生基因的宏转录组和宏蛋白质组水平（MT数据的标准化相对表达和MP数据的标准化相对光谱计数）被分配给基于FOAM的功能类别。MT和MP值的皮尔逊相关系数（r）显示在每个面板的标题中。面板按行优先顺序从平均MP相对计数的最高到最低进行排序。

4 原位和非原位时间序列的生态位特征

虽然我们确定了四种基本的生态位类型，但可以假定同居物种不能占据相同的实际生态位，从而导致相同类型和不同类型种群之间的实际生态位分离。我们假设必须存在不同程度的生态位重叠，从而导致不同程度的竞争。为了更好地了解已实现的生态位的互补性，我们使用功能组学数据研究了rMAGs如何与其编码基因重叠以及rMAGs表达谱如何变化。前者代表具有重叠特征的种群之间的竞争，而后者则是个体种群的适应性和总体生存策略的重要因素。我们根据MT/MG比率以及MP数据和所得时间点特异性表达谱之间的计算距离区分了表达和未表达的KO。尽管基于潜在功能的隔离保留在表达谱的聚类中（尤其是对于FunC-2），但FunCs-1，FunCs-3和FunCs-4的表达谱比FunCs-2的重叠程度更高（图6a）。与FunC-3和FunC-4的rMAG相比，FunC-1分配的两个厌氧菌种群似乎表现出相似的功能，并且在在按时间点对表达谱进行聚类时rMAGs的一个子集也显示出更高的MT/MG比率总体活性。总体而言，根据每个时间点的KO表达状态的聚类没有表现出基于FunC的分组而出现分离。这表明各个rMAG倾向于比判别性KO更频繁地表达共享的KO，因此增加了对特定底物的竞争。

为了研究单个判别功能的重要性，我们根据基因表达和MP计数选择了rMAG聚类，并为其分配了两个最丰富的rMAG（D51_G1.1.2，A01_O1.2.4）。我们观察到，rMAG D51_G1.1.2（微丝菌）一致地分类的聚类显示出少数KO的表达，其中大多数是核糖体蛋白，TCA循环相关的酶，如丙酮酸，苹果酸和3-磷酸甘油醛脱氢酶，伴侣蛋白，最常见的是WhiB家族的转录调节因子（19个时间点）。

含有rMAGA01_O1.2.4（不动杆菌）的聚类通常表现出与运动性和趋化性以及应激反应相关的基因表达，但也具有与积累磷酸盐相关的功能，例如K08311和K00937。与脂质代谢有关的KOs也经常在这些聚类中表达，例如，酰基甘油脂肪酶（35个时间点）或二酰基甘油O-酰基转移酶（25个时间点）。这表明关键功能的高表达是这些聚类中种群策略的组成部分，即使它们在编码功能方面有所不同。

接下来，本文研究了观察到的高活性种群之间的区别如何与表型可塑性相关联。由于BWWTP中交替的氧气水平在选择脂质积累类群中起着重要作用，因此在实验室规模的实验中，在不同的氧气波动条件下，我们添加了油酸（微丝菌的首选碳源）（图1）。这些非原位条件涉及需氧，缺氧，需氧预处理的生物质，然后每小时进行缺氧交替，以及缺氧预适应后的每小时需氧交替。与原位样品相比，FunC-1和FunC-3的MT/MG比非原位更高，而FunC-2和FunC-4 rMAG的MT/MG比则相反（图6b）。此外，特别是对于FunC-3，平均MT/MG比在有氧条件下最高，在无氧条件下最低。这与FunC-3主要由β-变形菌纲和γ-变形菌纲组成有关，这两个细菌纲水平主要包括好氧菌属。根据分类分配对rMAG进行分组时，我们在更微观的程度上观察到了具体的活性差异（图6c）。尽管酸微菌和放线菌纲（FunC-1）在原位实验时间尺度上表现出最低的平均MT/MG比例（0.5），该比率是在所有条件下的非原位实验的两倍高，原因是由于油酸脉冲扰动。β-变形细菌（FunC-3）表现出相似的结果，而γ-变形细菌（FunC-3）则表现出随着氧含量增加而活性更高的趋势。我们观察到原位时间序列中分配给厌氧绳菌纲和螺旋体门的rMAGs具有较高的活性。有趣的是，螺旋体门在非原位实验中并非如此，这表明需要额外的底物。厌氧绳菌科rMAGs与分类学相关的物种主要为厌氧菌，在交替条件下显示出最低的MT/MG比值，而变形杆菌rMAGs则显示出较高的MT/MG比值。总体而言，在交替条件下的差异响应指出了不同的短期和长期适应策略。

为了研究加入油酸后群落适应性变化的速度，我们比较了基线（0h时间点，在添加油酸之前）与5h和8h时间点（在添加油酸之后）。在5h时，参与TAG水解的脂肪酶在原位样品中表达水平较高，而在添加油酸后的非原位响应中出现下调。在5h时，与β氧化有关的基因数量增加，特别是在分配给FunC-3的rMAG中。在比较0 h和8 h时间点时，也观察到类似的效果。这表明基因表达的反应发生在5小时内，但不同种群的时间尺度不同。对表现出最高表达水平的TAG脂肪酶，DGAT/WS和PHB合成酶的种群进行的深入分析证实了先前确定的微丝菌作为BWWTPs中主要脂质蓄积剂的作用。结果还表明，厌氧绳菌科，钩端螺旋体和不动杆菌等种群在吸收LCFA和可用中性脂质的能力方面与微丝菌重叠。生态位的互补性和可塑性，即重叠基本生态位和实际生态位，以及基因表达变异性，使得种群可以在原位独立处理脂质。从生态系统的角度来看，该群落特质赋予了功能性抵抗力和弹性。

图6 实际生态位。a 基于MT/MG比或MP级别证据的时间点特异性表达谱的MDS。颜色表示不同的FunC。点形状表示基于嵌入点的自动聚类的聚类分配，椭圆显示了包含95％的群集分配数据点。点大小代表各个rMAG的平均MT/MG深度比。两个坐标轴上显示了前两个维度可以解释的变异程度。b根据条件显示了78个rMAGs在所有时间点上的平均MT/MG深度比；每组方框图对应于一个rMAG组（FunC-1 n = 24，FunC-2n = 23，FunC-3 n = 19，FunC-4 n =12），每个箱线图代表一个独立的实验。c在图的顶部（n）中显示了rMAG的分类以及每组rMAG数量分组的平均MT/MG深度比。

通过整合多元组学数据集，我们能够在原位或非原位追踪群落范围内和群体的特征。我们在该生态系统中发现了四种不同的基本生态位类型。分配给特定类型的种群具有相同的功能谱，并且在很大程度上具有相似的系统发育背景，这与先前观察到的代谢谱一致。同时，我们发现一些功能富集在多种生态位中，例如与脂质蓄积有关的功能。

尽管研究结果指出了功能补体，实际生态位和系统发育之间的联系，但我们还观察到了对个体生态位类型中不断变化的环境条件的响应而产生的独特活动，例如，一些低丰度的种群表现出较高的活性。这表明了功能聚类中的种群针对资源空间变化的独特适应方法，其中包括占主导地位的微丝菌种群。微丝菌通过基于表型异质性的方法来快速适应当前的环境条件。非原位验证实验表明，该方法在扰动后仅5小时即可适应底物有效性和溶解氧浓度的变化。基因表达的这种可塑性使种群能够抵抗环境条件的波动。此外，发现该方法对于微丝菌是独特的，这是因为特别在有氧非原位条件下，其他脂质积累和/或溶菌群的转录反应增强，例如不动杆菌属，钩端螺旋体或厌氧绳菌。

我们的工作强调了在混合群落中应对生物体特定的适应方法和时间框架的要求。在时间序列内，底物水平受到严重干扰之后，群落组成和基因表达模式发生了巨大变化。我们假设这种群落转移是过量的底物供应的结果，它限制了群落的抵抗力。个体种群在扰动后十个污泥龄周期内恢复，这表明群落的复原力也与表型可塑性相关。实际生态位的重叠反映了生态位的互补性。反过来，这取决于对底物的种间竞争，如油酸。关于人类肠道微生物组的其他独立研究强调了种间竞争对于在固定喂养方案下维持稳定性的重要性。种间竞争或缺乏竞争如何与弹性相关，是未来工作的关键问题。

重建种群水平基因组并从宏基因组推断其功能潜力可以使人们能够确定不同群落成员的基本生态位。通过MT和MP分析跟踪功能基因的表达，以及通过细胞内外代谢物的比较代谢组学分析解决的实际资源使用情况，可以突破关于实际生态位的固有观念，共同解决单个群体的基本和实际生态位宽度，对于理解微生物群落内的生态过以及如何响应干扰至关重要。结果表明多基因组学数据可以随着时间的推移深入表征生态位。由于活力可塑性和短暂扰动后的恢复，我们确认了抵抗力和弹性之间的关系是这种环境下资源竞争的函数。基本生态位和实际生态位的互补性可以保证提高稳定的生态系统服务，从而保证了混合培养生物技术过程的长期稳定进行。我们的结果为废水处理以外的应用做出了贡献，例如生态工程或宿主相关微生物的研究。

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