编译：橙，编辑：木木夕、江舜尧。

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英国伦敦大学学院遗传学研究所Chris P. Barnes等人突破之前人为设计微生物群落的限制，建立了基于计算机自动设计合成微生物群落的流程。该工作流程能够从一组系统自动生成候选目标出发，自动设计微生物群落的个体组成，并使用模型选择，在恒化生物反应器中确定候选系统产生稳定群落的最大可能性。这个工作流程还允许用户导出依照基本设计原则建立的稳定微生物群落以及控制群落组成的关键参数，在微生物生态研究中具有重要的应用意义。

1自动合成微生物群落设计器 (AutoCD) 的工作流程

图1解释说明本研究中开发和应用的工作流程AutoCD。首先，在恒化器环境中设置可用于构建稳定系统的可用参数，包括菌株数量（N）、细菌素（B）和群体感应QS系统（A）。任何群体感应QS系统都可以通过诱导或抑制来调节系统中细菌素的表达。所有模型中的菌株都依赖于单一的营养源，这些营养源被菌株消耗，并通过用新鲜培养基稀释恒化器进行补充。所有的模型都包含了亚种群之间基于营养的竞争关系。作者可以基于文献中已知的生化速率参数，对每个部分及其相互作用进行设置。作为模型空间生成器的输入参数，模型空间生成器执行一系列组合步骤来生成所有可能的遗传算法。然后，模型空间生成器构建表达不同遗传回路的菌株的独特组合，其中每个组合都是候选模型，并过滤了不可行的、冗余的组合，最终产生了一组独特的待评估候选模型。

图1 AutoCD的流程示意图

2 设计两个达到稳定状态的菌株共培养体系

作者将AutoCD应用于含有两个菌株的稳定共培养物的设计。在图2中，作者定义了一个由两个菌株（N1，N2）、两个细菌素（B1，B2）和两个群体感应QS系统（A1，A2）组成的模型空间。作者设置了模型空间限制，以实现可行的实验设计，允许每个菌株最多表达一个群体感应QS，每个菌株最多表达一个细菌素，每个菌株最多可对一种细菌素敏感。在这些条件下，模型空间生成器生成69个的模型（m0，m1…m68）。这69个模型作为一个统一的先验模型，作者通过模型选择，从可用的遗传部分来看，每个候选模型中的状态变量之间可能存在17种可能的交互选择。作者对每个模型中存在的交互进行层次聚类，根据交互的相似性对模型进行分组。这种聚类在图2a中显示为树状图，表明候选系统在产生稳定状态方面的有效性。m62具有最高的后验概率，并且系统最稳定（图2a）。m62由两个菌株组成，表现出交叉保护互惠关系。每个菌株表达一个正交的群体感应QS分子（图2b）。在没有相反菌株的情况下，限制性细菌素可以自由表达，其中一个菌株的灭绝将导致另一个菌株的灭绝。这种闭环反馈是m62拓扑的一个特点，克服了竞争排斥原理。

在设计新系统时，最小化遗传部分的数量将减少实验变量的数量，提高系统的易构建性和优化性。作者通过系统中表达部分的数量，对模型空间进行子集划分，从而确定在每个子集中具有最高后验概率的候选者（图2b）。作者发现这三个模型都有限制性基序，其中一个菌株对它产生的细菌素很敏感。然而，m48与m62相比，背后的证据不足以改善后验概率（图2b）。模型选择已经确定了产生稳定群落的最佳表现设计。但是，设计中使用的零件可能需要特定的特性或恒化器设置，流程还为每个模型生成后验参数分布，为作者提供产生稳定状态所需的参数值信息。图2c显示了m66和m66中几个可调参数的后验分布。趋化器的稀释率（D）是一个可直接调节的参数，细菌素的最大表达率（KBmax）可以通过启动子和核糖体结合位点的选择来调节。生长速率（μmax）可通过选择基础菌株或营养缺陷依赖性来调节。

图2 AutoCD流程的输出结果

3 限制性基序可以稳定两个达到稳定状态的菌株共培养体系

非负矩阵分解（NMF）是一种无监督的方法，机器学习方法可以用来降低交互空间的维数。NMF通过学习多个簇（K），可以通过这些簇的加权和来重建模型。在作者的例子中，这些簇可以表示为相互作用基序。作者设置K=4，以便对模型空间给出一个易于理解的总结。图3a显示了可以用来表示整个模型空间的学习主题。图3b显示了每个模型的组件权重，定义了每个模型对每个主题的隶属度。这些模型按后验概率的降序排列，可以看到K1在性能最好的模型中权重很大。基序K1仅指菌株对其产生的细菌素敏感的限制性相互作用（图3a，b）。顶部模型始终为K4（图3a，b）分配低权重，这是一个仅涉及OL相互作用的基序，其中菌株对另一菌株产生的细菌素敏感（图3a）。

作者使用NMF产生的适应症来治疗作者自己的疾病离散的主题，提高了解释的容易性。K1和K4向作者展示了细菌素敏感性是一个重要特征的方向，作者对此进行了进一步的研究。根据细菌素敏感性的方向，所有模型都可以通过组合8个基本基序来构建，这些基序可以被分类为限制性。在每一类中，基序都是通过细菌素调节的方式来区分的（图3c）。对于每个模型，作者确定模型空间中的最近邻，可以通过添加每个基序来构建，并计算每个邻居的后验概率变化（图3d）。通过在整个模型空间中重复这一点，作者能够量化一个基序是稳定的还是不稳定的（图3e）。

图3 网络基序对稳定性的贡献程度

4 设计达到稳定状态的三菌株群落

虽然一些研究已经证明有能力建立合成的两个菌株系统，但对三个菌株的研究却很少。在演示了两个菌株系统的自动化设计之后，作者接下来将解决设计稳定的三个菌株群落的更大挑战。单一应变的增加显著增加了参数空间、工程选项和可能的相互作用。作者定义可用的由三个菌株（N1、N2、N3）、三个细菌素（B1、B2、B3）和两个正交群体感应QS系统（A1、A2）组成的部分。主要有相同的菌株工程限制，每个菌株最多允许一个群体感应QS表达和一个细菌素表达。每个菌株最多可对一种细菌素敏感。考虑到工程限制，模型空间生成器产生4182个独特的模型。由于模型的数量要多得多，作者根据每个模型中的交互作用对模型进行分组，分为五个层次，显示了每个簇的平均后验概率（图4a）。3289个模型的后验概率为零，突出了这种设计方案的难度。ABC SMC将m4119确定为产生稳定状态后验概率最高的系统。m4119由两个群体感应QS分子组成；A1由N2产生，A2由N3产生（图4b）。

群体感应QS分子抑制每个种群产生的限制性细菌素的表达。作者根据系统中异源表达的数量对模型空间进行分组，产生包含三个、四个、五个和六个表达部分的候选模型的子集（图4b）。含有两个异源表达部分的模型的后验概率均为0.0，未显示。同样，作者看到随着复杂性的增加，后验概率的增加越来越小。m3938是m4119更复杂的邻居，N1也参与了A1的产生，导致后验概率下降。当从m4125移动到m4119时，后验概率的增加，表明两个模型的后验概率之间的差异不大。这些系统比较突出了增加复杂性和提高系统性能之间的权衡。

图4 AutoCD输出结果

5 多重工程细菌素比多重正交群体感应体系更重要

作者的结果已经确定了两个达到稳定状态的菌株共培养体系和三个达到稳定状态的菌株共培养体系中表现最好的模型，还强调了在性能最好的模型中，随着模型复杂性的增加，效益会逐渐减少。接下来，作者将总结不同部分的重要性以及它们对稳定状态客观行为的贡献，进一步使作者能够对遗传部分进行分类，以便在实验室中进行构建。

图5显示了三个达到稳定状态的菌株共培养体系以及它们产生的平均后验概率。这为作者在三个达到稳定状态的菌株共培养体系的设计中形成启发式规则提供了重要的信息。图5a显示了比较两个群体感应QS系统而不是一个群体感应QS系统时非常相似的后验概率。图5b显示了抑制性群体感应QS调节细菌素产生的实质性优势。图5c显示了支持使用三种细菌素在三个达到稳定状态的菌株共培养体系中产生稳定状态。这三个统计数据表明，平均而言，使用两个群体感应QS系统没有什么优势，应该优先考虑使用一个抑制性群体感应QS来调节三个达到稳定状态的菌株共培养体系。

图5 与遗传部分数量相关的平均后验概率

6 确定三种菌株的稳态种群比率

自然微生物群落中含有的不同物种丰度在数量级上不同，物种之间共同构成一个群落功能。合成群落可以利用群落总产量，通过亚种群间遗传过程的分布，提高生物生产途径的产量和效率。利用共培养法进行的生物合成研究表明，优化接种率以最大限度地提高群落产量的重要性。因此，能够确定合成群落的稳态组成是一个有价值的特征。作者证明了后处理的一种形式可以应用到ABC-SMC的输出中，通过应用一个二级阈值，识别能够微调稳定态布居密度的关键参数。

图6a显示了m4119的群落组成分布。大多数可接受的模型显示出最终的群落组成，由单一菌株控制。应用一个二级阈值，可以确定如何调整系统以产生更均匀分布的群落组成。此外，作者设定了第二个门槛，规定所有菌株的OD必须大于0.1（粉红色）（图6b）。因此，不符合二级阈值的菌株具有0.001<OD<0.1（蓝色）（图6b）。从这两个子集中，作者生成单独的参数分布，并使用Kolmogorov–Smirnov（KS）计算分散度。显示最大分散度的参数分布对于将系统行为从单一应变占主导地位转变为应变密度分布更均匀的系统行为非常重要。图6c显示了具有最大分散度的四个参数的分布规律。细菌素表达率（KBmax1，KBmax2，KBmax3）与产生更均匀分布的群落组成有关，这三个参数实际上都是可调的。同时OD可以通过恒化器直接控制，而细菌素的表达率可以通过启动子和核糖体结合位点的选择来改变。

图6 模型4119的种群密度分布

迄今为止，人工合成的群落已经利用群体感应、代谢依赖性、细胞内裂解蛋白、毒素和细胞外AMPs来设计相互作用，从而形成合成群落。在设计一个综合群落时，系统本身的基本相互作用往往是通过模仿自然界中的生态相互作用或通过理性判断来指导的。随着可能的工程交互类型的增加，对大量模型空间进行综合评估的需求也随之增加，文章中演示的建模和统计框架解决了这个设计问题。通过案例，作者强调了重要的设计特点和启发式规则，以建立合成稳态群落。随着我们转向越来越复杂的系统，理解成对的相互作用可以用来建立更大的稳定群落。

作者开发的流程框架为设计-构建测试周期提供了一个自然的入口点，为构建一个具有所需行为的稳定的合成群落提供了一个基于数据的路线图。在两菌株和三菌株模型空间中揭示了稳定的稳态系统，并为它们的构造生成了有效的规则和启发式算法。研究人员可以灵活地运用该流程，快速重新定义新的合成菌群。

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