aBIOTECH | 河北农业大学赵建军/李君团队扩展芸薹属蔬菜中CRISPR/Cas9基因编辑靶向范围

大白菜和甘蓝属于芸薹属蔬菜作物，种植面积和消费量皆居前列，在保证我国蔬菜周年供应、保障人民生活中占有举足轻重的地位。基因编辑是新一代生物育种的关键技术，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于作物的遗传改良，但SpCas9识别的靶序列受到原型间隔序列毗邻基序（PAM）的限制，很难对基因组任意位点实现编辑，因此研究人员一直在尝试打破PAM限制。目前，已经获得识别不同PAM种类的工程化Cas9-NG、SpG和SpRY变体，这些Cas9变体主要在单子叶植物水稻中进行成功应用，能否在芸薹属蔬菜中发挥作用尚不清楚。

近日，河北农业大学赵建军/李君团队在 aBIOTECH 上在线发表了题为“Expanding the targeting scope of CRISPR/Cas9-mediated genome editing by Cas9 variants in Brassica”的研究论文，显著提高CRISPR/Cas9技术在芸薹属蔬菜中的编辑能力。

本研究首先对大白菜和甘蓝基因组的PAM数量进行分析，发现Cas9-NG/SpG变体在大白菜和甘蓝基因组中潜在靶位点数是SpCas9的两倍多，SpRY几乎可靶向基因组所有位点。随后，构建了植物CRISPR/Cas9-NG、CRISPR/SpG和CRISPR/SpRY基因编辑系统，进而通过大白菜/甘蓝原生质体的瞬时转化体系比较了Cas9-NG、SpG和SpRY变体在不同PAM位点的编辑效率和偏好性。NGS测序结果表明Cas9-NG和SpG可以靶向大白菜/甘蓝NGN PAM，且SpG较Cas9-NG具有更高的编辑效率，更适于NGN位点的编辑；SpRY在NNN PAM位点实现了高效的基因编辑，且在NRN PAM位点的编辑效率高于NYN。SpRY的编辑活性在再生甘蓝株系中得到了进一步验证，表明SpRY能够在芸薹属蔬菜中实现PAM-less的靶向编辑。

在此基础上，将SpRY(D10A)变体与定向进化后的大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶（TadA*-8e）融合，开发了SpRY-ABE8e单碱基编辑器。PCR/RE和Sanger测序结果表明SpRY-ABE8e单碱基编辑器对大白菜NNN PAM位点实现了高效的A-to-G替换。该研究开发了适用于芸薹属蔬菜的识别非典型PAM的基因编辑工具盒，有效扩展了SpCas9识别的PAM范围，为芸薹属蔬菜作物品种改良等提供了更广泛、高效、精准的新工具。

图1 利用Cas9-NG, SpG和SpRY变体扩展大白菜和甘蓝的基因编辑范围

河北农业大学生命科学学院博士研究生李文静和硕士研究生李璇为论文的共同第一作者，李君教授、李岩副教授和赵建军教授为论文的通讯作者，该研究得到国家自然科学基金重点项目、河北省重点研发计划、河北省自然科学基金培育项目和河北农业大学引进人才项目的资助。

引用本文：

Li, W., Li, X., Wang, C. et al. Expanding the targeting scope of CRISPR/Cas9-mediated genome editing by Cas9 variants in Brassica. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00155-7

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