杨鸽
Environmental Science & Technology|多组学与常规分析鉴定石墨烯基纳米材料的植物毒性和防
2024-6-18 22:47
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一、研究背景

石墨烯基纳米材料(GBNs)由于其独特的物理和化学性质已在环境保护、农业生产、医药、电子和化学等多个领域发有广泛研究,如其在环境保护方面作为污染物的吸附剂、纳滤膜和污染物的光催化降解应用于环境保护;在农业生产中应用于刹虫剂的增效剂、农业传感器和缓释肥料载体等;其在环境保护和农业生产中的应用不可避免会释放到生态环境中影响植物,植物对其表现出有幼苗生长、发芽、光合作用的抑制作用,增加氧化压力、干扰植物的代谢、蛋白和基因形成。而又有些研究表示GBNs对植物有促进其生长速率、延长根、增长叶子的表面积、数量和增加生物量等。GBNs会影响到植物的性能,所以了解其对于植物的毒性作用和植物对其的防御机制尤为重要,现已有些GBNs对植物毒性的报道,但其在食用蔬菜中的相关研究尚无报道,辣椒是世界上重要的农业蔬菜,由于GBNs对于植物根系发芽的影响的研究并不能反映其在果实中的安全性,而GBNs的不同形态有不同的物理化学性质,而茎注入在农业中是植物抵抗外源胁迫、调节幼苗生长的有效暴露方式。本研究中,作者通过茎注射的方式将长期暴露于(42天)于不同氧化态和尺寸的石墨烯,如氧化石墨烯(GO)、还原氧化石墨烯(rGO)和氧化石墨烯量子点(GOQDs)中辣椒叶片和辣椒果实的毒性程度及其通过光合作用、氧化应激、激素调节发挥作用的防御机制。

二、技术手

实验材料:利用GBNs与植物鲜重的比例分别为0.25,2.5和25mg/kg对辣椒茎干注射GBNs;

研究方法:高通量蛋白组和代谢组学

三、主要结果

1. 通过降低植物钙含量、蒸腾速率和气孔导度介导的植物防御

GBNs显著降低了叶片的净光合速率、蒸腾速率。GO、rGO和GOODs的净光合速率分别比对照组低11.8−33.7%、26.6−30.5%和22.2−23.3%(图1a)。净光合速率的降低可归因于细胞间CO2浓度的降低,与对照组相比,氧化石墨烯、还原氧化石墨烯和氧化石墨烯组细胞间CO2浓度分别降低了12.0−24.4%、16.2−35.2%和23.9−32.8%(图1b);气孔导度分别下降了16.9-38.2%,36.2-42.0%,42.1-50.5%(图1c);暴露于rGO和GOOD的气孔下降程度低于暴露于GO,气孔是植物CO2扩散和水分蒸腾的场所,气孔导度的降低是细胞间CO2浓度和蒸腾作用下降的原因(图1b、d);钙在细胞壁构建、膜稳定、细胞内信号传导调控等方面发挥重要作用,是植物必需的营养元素之一。在本实验中,与对照组相比,GO、rGO、GOQDs的钙水平分别显著降低了21.7−24.4%、30.1−43.8%和27.7-48.3%(图1e);此外,如图S3所示,其他营养元素(如Mg、K、Mn和Zn)表现出与Ca相似的减少。上述结果表明,所有GO、rGO和GOQD都降低了光合作用、细胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾作用,并且rGO和GOQD诱导的减少强于GO诱导的减少。蒸腾速率、细胞间CO2浓度、Ca含量和气孔导度的降低也表明了植物对胁迫的防御反应,这与随后的代谢产物表达一致(图1f)。

图1 GBNs对辣椒叶片光合作用的影响 (a)净光合速率(a,μmol/(m 2 s))。(b)细胞间CO2浓度(C,μmol/mol)。(c)气孔导度(gsw, mol/(m2 s))。(d)蒸腾速率(E, mmol/(m2 s))。(e)辣椒叶片中的钙含量。DW,干重。黑色“*”表示暴露组与对照组差异显著(p < 0.05)。红色“*”表示氧化石墨烯组与还原氧化石墨烯组之间差异显著(p < 0.05)。蓝色“*”表示氧化石墨烯组与氧化石墨烯组之间差异显著(p < 0.05)。

图2 辣椒果实中的GBNs表征。(a−c)辣椒果实中GO、rGO和GOQD显微图像。(d−f)辣椒果实中GO、rGO和GOQD的拉曼光谱。(g)GBN从茎髓向果实转移的示意图。

2. 与光合速率和钙含量相关的代谢

为了全面研究GBNs在叶片中的不良作用及防御机制,作者进行了代谢组学分析,通过GC-MS共鉴定到94种代谢物(图4),鉴定到的代谢物涵盖了碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和其他小分子典型的的代谢途径,这与之前的代谢组学结果相符。具体而言,DO,rGO,GOQD分别下调了28、32和30种代谢物,上调36、29和32种代谢物(图5),这表现了纳米材料表面氧和尺寸的不同产生的代谢差异。

3. 抗氧化防御系统的崩溃

如图3a所示,GO、rGO和GOQD显著提高了辣椒果实H2O2的产量,且rGO和GOQD诱导的氧化应激强于GO,这与以往对单细胞藻类的研究结果一致。与对照组相比,GO,rGO和GOQD组的抗氧化剂CAT活性均下降(图3b),H2O2含量的增加和CAT活性的降低进一步诱导了植物的氧化损伤。而辣椒果实中MDA含量均比对照组高(图3c),而rGO和GOQD中MDA含量升高高于GO,这与H2O2含量升高一致,而MDA是植物细胞膜脂质过氧化的生物标志物,MDA含量的增加表明膜脂过氧化和膜系统损伤(如膜渗漏和组织恶化)。图S9电镜图显示GBNs引起的严重细胞壁损伤,这与图3d的表型一致。如图3e所示,氧化还原是受所有GBNs干扰最强烈的生物过程。图f所示为上述的氧化应激示意图。

图3 GBNs对辣椒果实氧化应激的影响.(a)辣椒果实中H2O2含量。(b)辣椒果实中CAT活性。(c)辣椒果实中丙二醛含量。黑色“*”表示对照组与暴露组之间有显著差异(p<0.05)。红色“*”表示氧化石墨烯组与还原氧化石墨烯组之间差异显著(p<0.05)。蓝色“*”表示GO组与GOQD组间差异有统计学意义(p< 0.05)。(d)GBNs对辣椒果实的生理影响。(e)根据Gene Ontology Consortium数据库,GO、GOQD和rGO组DEPs的前十大生理过程。纳米材料的检测浓度为25μg/kg鲜重。(f)GBNs诱导氧化应激示意图。绿色和红色框中显示的文本分别代表下调和上调的反应。

4. 激活植物激素防御系统

如图4a,b所示,rGO、GOQD通过蛋白A0A2GY6P4(赤霉素调节蛋白10-like)来上调GA水平,这与辣椒果实中GA含量一致;与对照组相比,处理组的ABA水平明显更低(图4c),A0A0K0K9J6(蛋白描述为ABA不敏感萌发蛋白1)在rGO作用下明显上调,这与ABA含量的降低一致(图4d)。

图4 辣椒果实暴露于GO、rGO和GOQD的激素水平和分子机制。(a)赤霉素酸(GA)含量。(b)与GA相关的蛋白质。(c) ABA含量。(d)与ABA相关的蛋白质

5.蛋白质组学和代谢组学结果一致指向碳水化合物和氨基酸代谢

该研究共在辣椒果实样品中鉴定到63种代谢物,包括碳水化合物、氨基酸、醇类、脂肪酸和其他小分子酸,为了全面了解GBNs引起的植物生理紊乱,作者对差异表达的代谢产物和DEPs进行了PPI分析,KEGG富集通路表示DEPs主要参与遗传信息处理和代谢。显示了蛋白质和代谢产物在转录、翻译、折叠、分类和降解以及复制和修复之间的相互作用。rGO和GOQD组中上调的蛋白质和代谢产物比GO组更多,反映出其对应激抵抗蛋白质的需求更强。

辣椒叶片和果实暴露于GBN后的植物毒性和防御反应见图6。GBN降低了叶片气孔导度、蒸腾速率和细胞间CO2浓度,抑制了纳米材料的吸收。上述防御反应与光合速率抑制同时发生,且还原氧化石墨烯和GOQD的作用强于GO(图6a)。如图6b所示,GBN下调了辣椒果实的碳水化合物代谢(如半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢),这与叶片净光合作用的降低是一致的。同时,一些应激防御反应通路被激活,如上调的翻译过程(如氨基酰基-trna生物合成)、氨基酸代谢途径(如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢)、GA信号通路和ABA受体PYL8调节途径,尤其是还原氧化石墨烯和GOQD组。

图5  参与氨基酸代谢的蛋白质和代谢物的PPI分析。黑色、红色和紫色箭头分别表示GO、rGO和GOQD诱导的蛋白质或代谢物水平的显著改变。绿色和黄色的方框分别代表蛋白质和代谢物。向上和向下的箭头分别代表上调和下调的蛋白质或代谢物表达。  

图6 暴露于GBN的辣椒叶片和果实可能的毒性反应和防御机制示意图。(a)叶片对GBN的响应示意图。(b)果实对GBN的反应示意图。绿色框和红色框中显示的文字分别代表下调和上调的反应。

6.环境健康影响

蛋白质组学和代谢组学一致表明,rGO和GQOD分别干扰了与光合作用毒性和防御反应相关的碳水化合物和氨基酸代谢等关键代谢途径。随着时间的推移,rGO和GOQD比GO更容易在盐溶液中聚集,这可能导致rGO和GOQD的植物毒性降低。GO处理(100和250mg/L)促进了铁的转运,导致铁在茎部过量积累,这是纳米材料植物毒性的新机制。

此外,在土壤暴露中,纳米材料会与环境基质相互作用,改变其毒理学特性。在防御反应中,植物对纳米材料的吸收可以通过调节蒸腾速率、气孔导度和钙含量来减少,尽管在蔬菜作物的可食用部分中对GBNs的吸收、迁移和转化方面还有待继续研究,但GBNs均可进入辣椒的果实部分引发生理障碍。

四、研究结论

GBNs通过降低钙含量(21.7-48.3%)、细胞间CO2浓度(12.0-35.2%)、蒸腾速率(8.7-40.2%)和气孔导度(16.9-50.5%)来调节植株防御。通过胞吞作用和跨膜作用的进一步验证了植物应对胁迫的防御途径,高通量蛋白组和代谢组结果表明,碳水化合物的下调和氨基酸代谢物的上调分别是植物毒性和防御机制背后的主要因素。

编辑:qingqin H

审核:Tao Li

参考文献

Li X, Sun S, Guo S, et al. Identifying the phytotoxicity and defense mechanisms associated with graphene-based nanomaterials by integrating multiomics and regular analysis[J]. Environmental Science & Technology, 2021, 55(14): 9938-9948.

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