杨鸽
Plant Physiology|干旱胁迫下毛果杨茎分化木质部的表观转录组和蛋白质组变化
2024-6-18 22:46
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一、研究背景

了解基因表达与调控间的关系需对RNA转录、加工、修饰和翻译过程有深入的了解。干旱是主要影响植物植物生长的非生物胁迫,目前植物进化了多种响应机制与基因的重编码来应对干旱环境,因此获取这过程中的转录和翻译信息对于理解干旱胁迫下的分子机制很重要。

然而,目前干旱胁迫下毛果杨(Populus trichocarpa)的表观转录组与蛋白质组间的关系尚不清楚。在该项研究中,作者利用纳米孔直接RNA测序技术(Nanopore Direct RNA-seq ,DRS)和基于串联质谱标签(Tandem mass tag ,TMT)的蛋白质组学来分析研究干旱胁迫下茎分化木质部(SDX)的表观转录组和蛋白质组学调控,揭示了干旱胁迫下毛果杨SDX中N6-甲基腺苷(m6A)、多聚腺苷酸化、poly(A) tail length(PAL)和翻译之间的相互作用。

     

二、研究手段

研究对象:3个月的毛果杨,取对照组为无干旱处理(ND)毛果杨苗,实验组为5天(D5)和7天(D7)干旱处理后的SDX进行DRS和TMT蛋白组学分析。DRS做2个生物学重复,TMT蛋白组学分析做3个生物学重复。

研究方法:Nanopore DRS;TMT蛋白组学分析;RT-qPCR;LC-MS/MS

三、研究结果

1.干旱处理后,全长转录本的比例下降

DRS检测全长和非全长reads,结果显示,非全长reads显示出极端的3'偏好 (图1C);在干旱处理后,全长reads的百分比下降(图1D、E); D5 vs ND和D7 vs ND分别有546个和2004个基因全长reads降低,而全长reads增加的基因很少(图1F、G),干旱处理后全长reads比增加的基因在ND中的全长reads比非常低(20%),而全长reads比较低的基因在ND中显示出较高的全长reads比(40%)(图1H)。

图1. 干旱胁迫下SDX的纳米孔DRS检测结果。A, 利用DRS和TMT标记分析干旱胁迫引发的表转录组和蛋白质组变化流程图。Nanopolish、PRAPI和Nanom6A是三种用于长 read分析的管道。B, 热图显示ND, D5和D7样本在全长和非全长读数之间的Spearman相关性。C,转录本全长和非全长读段的覆盖率。D,柱状图显示了干旱胁迫下全长read比的动态变化。E,Wiggle plot, histogram, and RT-qPCR显示干旱处理降低了DUF239的全长读取率。差异显著性采用t检验和利用星号评级 (*P < 0.05; **P < 0.01). Total_F/Total_R和Full_F/Full_R是引物位置。F,散点图显示干旱处理后不同的全长比。G,维恩图显示了D5与ND和D7与ND比较中具有增加的全长读取比的基因重叠。H,箱线图显示ND、D5和D7样品中不同全长读比基因的比例分布。box代表第25和75个百分位数;中位置线,第50个百分位数;晶须,第10百分位和第90百分位。圆圈表示离群值。

2. 干旱胁迫下,差异表达蛋白(DEPs)与差异表达基因(DEGs)存在显著重叠

ND、D5和D7的蛋白质组分析共鉴定出9872个蛋白对应的86904个肽段,与ND相比,D5与D7分别鉴定出802个DEPs(491个上调,311个下调)和821个DEPs(467个上调,354个下调),然而D5和D7之间的DEP很少(图2A、B),这表明干旱处理引起的蛋白质丰度变化在D5阶段已经完成。对DEPs进行GO分析,发现,在干旱处理后,上调DEPs (D5 vs ND)显著富集的GO项是“抗氧化活性”、“谷胱甘肽过氧化物酶活性”和“胚胎发育”,而上调的DEPs属于与纤维素生物合成相关的蛋白质(图2C)。进一步研究干旱胁迫下蛋白质丰度与mRNA水平之间关系的一致性,发现大约61.3%(301/491)和68.2%(212/311)的上调和下调蛋白在D5与ND的mRNA水平上被鉴定为差异表达,大约64.9%(303/467)和62.1%(220/354)的上调和下调蛋白在D7与ND的mRNA水平上被鉴定为差异表达(图2D、E)。

图2. 干旱胁迫下SDX的质谱蛋白质组学研究。A,火山图分别显示了D5与ND、D7与ND、D5与D7的DEPs。B, DEPs热图。深蓝色和浅黄色分别代表高和低蛋白质丰度。C, D5与ND的两两比较分别显示,分布在上调(左)和下调(右)蛋白中富集了GO term。D和E,维恩图显示D5与ND (D)和D7与ND (E)中DEPs和DEGs间的重叠。

3. 干旱胁迫下,蛋白质丰度和mRNA表达的相关性下降

文中通过对DRS进行TMT标签技术研究了干旱胁迫下全长和非全长RNA的mRNA表达和蛋白丰度(Rp)的Pearson相关系数,并对得到的数据做归一化处理,结果显示,随着标准基因表达阈值的增加,全长RNA和非全长RNA的Rp均下降(图3, A和B),这与之前其发表的PacBio Iso-Seq data的数据趋势相同,此外,作者还观察到干旱处理下RNA和蛋白质之间的相关性降低,这表明在干旱胁迫下RNA表达和蛋白质丰度的变化是不同的(图3, A和B)。

为了比较全长RNA和非全长RNA的Rp 差异,作者利用GO term对全长RNA和非全长RNA进行下游分析,结果显示D5(图3D)和D7(图3E)的ND(图3C)非全长的RNA相比全长RNA均具有更高的Rp,为了进一步探讨干旱胁迫下Rp 的变化,作者对ND的D5和D7的GO terms重叠区进行分析,结果发现全长RNA中的Rp 在6个GO term中有提高,而在17个GO term中有下降(图3F),Rp在涉及半胱氨酸型肽酶活性的term中增加,Rp 在与氧胁迫关联的term中下降。经过干旱胁迫后的非全长的RNA,Rp在5个GO term上升,在34个GO term中下降(图3G)。Rp 在具有蛋糖基化功能term中升高,在氧化应激和其他应激反应中降低(图3G)。

图3. 干旱胁迫下蛋白质丰度与mRNA表达的相关性。A\ -B,全长(A)和非全长RNA (B)不同RPM阈值水平的Rp 线形图。C - E, ND (C), D5 (D)和D7 (E)中基于GO term的全长RNA和非全长RNA间不同Rp的散点图。F,热图显示干旱处理下全长RNA Rp 的变化。heatpap的颜色(深蓝色到红色)表示相关性(从低到高)。G,热图显示干旱处理下非全长reads Rp变化。

4. 干旱胁迫下m6A的动态变化

对m6A谱的转录组分析显示,所有样本的m6A峰主要分布在编码序列和3'-UTR中(图4A、B)。在干旱胁迫下,平均m6A比值增加(图4C),其中木材形成基因的mA比例增加,并伴有mRNA(图4E)和蛋白(图3F)的表达下降,表明m6A可能在胁迫下抑制木材形成中发挥作用。研究者进一步鉴定了差异表达的m6A (DE m6A)位点。与ND相比,D5共有1048个m6A降低,775个m6A升高,而D7与ND相比,1295个位点的m6A下降,717个位点的m6A增加(图3G),结合转录组数据分析DE m6A位点与基因表达之间的关系,在D5和ND中鉴定出457个具有DE m6A位点的DEG,其中,在mUP-gDN(m6A比例增加,基因表达减少)类别中(图4I,象限II),干旱胁迫降低了13个成木基因的表达,m6A比例增加,这与m6A甲基化通常与转录丰度呈负相关是一致的。此外,干旱胁迫下SDX中的m6A比率与蛋白质丰度和H3K9ac水平之间的关系表现出与基因表达相似的趋势(图4J、K)。

图4. 干旱胁迫下m6A甲基化的动态响应。A, m6A甲基化位点在转录本的分布。B,柱状图显示ND、D5和D7中包含UTR和CDS的注释基因区域中m6A位点的百分比。C,箱线图显示ND, D5和D7的m6A比率。D - F,箱形图显示ND、D5和D7木质形成基因的m6A比率(D)、基因表达(E)和蛋白水平(F)。框限代表第25和75个百分位数;中线,第50个百分位数;晶须,第10百分位和第90百分位。G,散点图显示D5(左)和D7(右)干旱处理后m6A变化差异(mod)。H, 转录因子WLIM1的差异m6A修饰。I - K, D5与ND两两比较的散点图显示了m6A比例与基因表达(I)、蛋白水平(J)和H3K9ac水平(K)的关系。

5. 干旱胁迫促进远端poly(A)位点的使用

CPSF30控制选择性聚腺苷酸化(APA)位点的选择。在干旱胁迫下,Ptr-CPSF30的表达上调,并且Ptr-CPSF30的近端poly(A)位点利用率(近端/远端和近端,PPR)下调(图5A)。发现在干旱胁迫下,AAUAAA和1-nt变异的poly(A)信号比略有增加,而UCGUUU和1-nt变异的poly(A)信号比略有下降(图5B、C)。与ND相比,D5和D7的PPR降低的基因更多,揭示了干旱胁迫下远端poly(A)位点的使用增加(图5D、E)。对显示PPR升高和PPR降低的基因分别进行GO富集分析,发现PPR升高的基因参与“纤维素合成酶活性”和“纤维素生物合成过程”,PPR降低的基因参与“蛋白去磷酸化”和“蛋白酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性”(图5F-I)。

图5.在响应干旱胁迫中,poly(A)位点使用的动态变化。A,柱状图显示经RT-qPCR验证的干旱处理下CPSF30的表达增加和PPR降低。差异显著性采用t检验,采用星号评分系统(*P < 0.05;** p < 0.01)。B和C,注状图显示干旱胁迫下AAUAAA(和1-nt变化)(B)和UCGUUU(和1-nt变化)(C)六聚体基序的百分比。D,散点图显示PPR响应干旱胁迫变化。E, Wiggle图和柱状图显示IBR5的PPR下降(Potri.014G160500)。F/H,GO富集分析中基因分别的PPR的增多(F)和PPR的下降展示。G/I, Wiggle图和柱状图显示CESA7和VAB2作为PPR增加(G)和PPR降低(I)的基因的例子。

6.干旱胁迫诱导不同的PAL

利用DRS产生的全长poly(A)尾序列,确定ND、D5和D7样本的PAL中位数分别为79、80和75 nt(图6A)。PAL中位数最长的10个GO具有“转录共调节活性”和“激素应答”功能,PAL中位数最短的10个GO具有翻译和核糖体组成功能(图6B)。干旱胁迫下PAL增加最多的5个基因功能组(D5>ND)均与蛋白质加工有关,而PAL减少最多的5个基因功能组(D5<nd)的主要功能是酶活性和对激素的响应(图< span="">6C)。内含子保留(IR)reads具有更长的poly(A)(图6D)。

图6. 差异PAL对干旱胁迫的响应。A,小提琴图显示ND, D5, D7的PAL中位数。水平虚线表示PAL为80 nt。B,箱形图显示了ND中PAL最长的10个GOterm(橙色)和PAL最短的10个GO项(蓝色)。box代表第25和75个百分位数;中线,第50个百分位数;晶须,第10百分位和第90百分位。虚线表示PAL为80 nt。C,箱形图显示基因功能组在D5与ND(上)和D7与ND(下)中PAL(左)增加最多,PAL(右)减少最多。A,表示“激酶活性”;B,“核苷酸切除修复”;C,“蛋白质去泛素化”;D,“蛋白质代谢过程”;E, G蛋白偶联受体信号通路;F,“激素反应”;G,“n -乙酰转移酶活性”;H,“类异戊二烯生物合成过程”;1、“蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性”;J,“含核碱基化合物代谢过程”;K,“金属离子跨膜转运体活性”;L,“大核糖体亚基”;M,“蛋白磷酸酶2A型调节剂活性”;N,“蛋白磷酸酶2A型复合体”;O代表“微管运动”;P,“微管运动活性”;Q,“驱动蛋白复合物”。水平虚线表示80 nt的PAL。D,箱形图表示完全拼接(no_IR)和IR转录本的PAL分布。虚线表示no_IR和IR转录本中位PAL。

7. PAL与转录水平和翻译相关

根据转录物丰度将基因分为三类:高、中、低丰度,发现高表达基因倾向于较短的PAL,而低表达基因倾向于较长的PAL(图7,A-C)。高表达基因倾向于富集最优密码子,并在ND、D5和D7中分别表现出对短PAL的强烈偏好(图7,D-F)。通过累积分数分析,观察到具有低、中、高水平最佳密码子的转录本在PAL分布、mRNA丰度和蛋白质丰度方面存在显著差异(图7,G-I)。然而,无论是干旱处理还是干旱处理,PAL和蛋白质丰度之间都没有实质性的关联(图7,J-L)。综上所述,这些结果表明高表达的转录本对短PAL有强烈的偏向。

图7. 高表达转录本倾向于较短的PAL。A - C为PAL分布于ND (A)、D5 (B)、D7 (C)基因中的不同表达水平。最高、中、最低分别代表500个表达量最高的基因、500个表达量最接近中位数的基因和500个表达量最低的基因。P-value采用曼-惠特尼U检验计算。D - F,热图表示ND (D)、D5 (E)和D7 (F)中最优密码子频率(Fop)和PAL之间的关系。G - I,累积总和图显示翻译效率(密码子优化)与PAL (G)、mRNA丰度(H)和蛋白丰度间(I)之间的关系。J - L,PAL在ND (J)、D5 (K)、D7 (L)不同蛋白水平池中的分布情况。p值采用曼-惠特尼U检验计算。

四、结论

本研究揭示了干旱胁迫引发的毛果杨SDX表观转录组和蛋白质组变化的全面概况。在干旱处理下,全长读比降低,m6A刺激纤维素和木质素相关基因的RNA降解。此外,干旱胁迫促进了包括CPSF30在内的许多基因向远端poly(A)位点的转移。最后,PAL与全长读取率和m6A修饰率有关。总之,这些发现极大地扩展了关于干旱对基因表达转录后影响的理解。

编辑 :qingqin H审核:Tao Li

                                                                                                       

参考文献

Yubang Gao, Xuqing Liu, Yandong Jin, Ji Wu, Shuang Li, Yaxing Li, Binqing Chen, Yaxin Zhang, Linxiao Wei, Wei Li, Ruili Li, Chentao Lin, Anireddy S N Reddy, Pankaj Jaiswal, Lianfeng Gu, Drought induces epitranscriptome and proteome changes in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa. Plant Physiology. 2022 Sep, 190(1):459–479.

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