杨鸽
Food Chemistry|多维质谱组学揭示香蕉果肉中类胡萝卜素生物合成途径
2024-6-18 22:41
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一、研究背景

香蕉( Musa spp .)果肉中主要积累叶黄素、α -胡萝卜素和β -胡萝卜素,但其相对含量具有丰富的遗传多样性。为了全面了解类胡萝卜素的代谢,并考虑到转录调控似乎并不是影响类胡萝卜素积累的唯一调控机制,蛋白质组学和代谢组学分析可为影响这些重要代谢物性状积累的因素提供独特的见解。类胡萝卜素在大蕉和卡文迪许(Cavendish)香蕉果实中存在不同的积累机制且这两种机制仍然是未知的。因此,该研究通过对两个品种果实果肉中类胡萝卜素含量、类胡萝卜素合成相关基因的表达水平以及代谢组和蛋白质组也进行了分析,来研究其果实发育过程中果肉中类胡萝卜素的生物合成。

二、研究手段

研究对象卡文迪许品种GN和芭蕉品种ON。香蕉果实于(阶段1:S1,开花后5周;阶段2:S2,开花后13周;阶段3:S3,开花后17周(GN)和21周(ON))开花后取样。每个香蕉基因型采集3个生物学重复。

研究方法

HPLC分析;qRT-PCR分析;LC-MS/MS 蛋白质组学分析;GC-MS代谢组学分析

三、研究结果

以卡文迪许(Cavendish)品种GN和芭蕉品种ON为研究对象。根据果实的发育情况,选择三个阶段(即上述的S1、S2和S3阶段)进行取样。在果实发育过程中,ON的果肉颜色比GN更加橙黄(图1A)。

α-胡萝卜素是两个品种中含量最高的类胡萝卜素,在S2后含量急剧增加(图1B和C)。S3时,GN和ON果肉中类胡萝卜素的总含量分别为0.6和6.9 μg/g FW。ON果肉中类胡萝卜素的积累量比GN高10.5倍(图1B,图1C)。

1 GNON的果肉颜色和类胡萝卜素概况。AGNON在不同发育阶段的果肉颜色。BGN不同发育阶段的类胡萝卜素谱。C,ON不同发育阶段的类胡萝卜素图谱。注:GN:白色果肉栽培品种。ON:橙色果肉栽培品种

1. 初级代谢组数据揭示了ON果肉中更多的可溶性糖和更少的氨基酸积累

使用基于GC-MS的代谢组学方法分析了S3 (n = 6)的ON和GN果肉的初级代谢组。实验设计和生物学重复的概述如图2所示。在果肉中共检测到84个代谢物峰。ON和GN样品中检测到的代谢物信息见附表S1。根据正品标准品的特征,最终确定了52个代谢物(来自55个代谢物峰) (表S1 )。其中,糖代谢相关化合物16个,氨基酸代谢相关化合物20个,有机酸33个,脂肪酸5个,其他化合物7个。

2 蛋白质组和代谢组分析的实验设计示意图。注:GN:白肉栽培品种;ON:橙肉栽培品种。a, b and c:同一棵树上的三个果实。S1、S2和S3:第一阶段、第二阶段和第三阶段

交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)的得分图显示,ON和GN的代谢组可以明显区分(图3A )。S - plot分析能够识别出区分两组的代谢物。如图3B所示,根据OPLS - DA模型,基于变量投影重要性分析( VIP )和| p ( corr ) |值,共筛选出15个代谢特征标志物并进行标记。15种代谢物中5种(蔗糖、葡萄糖、果糖、柠檬酸、油酸)在ON果肉中积累,(图3B ,红色标注)丰度增加,10种代谢物相对于GN果肉(图3B ,绿色标记)丰度降低。

图3 通过OPLS-DA模型对GC-MS数据进行配对比较得出的不同代谢物的得分图(A)和S图(B)。红点:高丰度代谢物,绿点:低丰度代谢物参与糖代谢的7种代谢物,包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、丙酮酸和葡萄糖酸,在ON中的相对含量比GN果肉高1.5倍以上(图4)。其他代谢物,如柠檬酸、油酸、异柠檬酸、脱氢抗坏血酸和7种推测的鉴定代谢物在ON中也有所增加(图4)。然而,涉及氨基酸代谢的12种代谢物在GN中的累积水平比在ON中高1.5倍,尤其是芳香族氨基酸生物合成途径中的代谢物,如酪氨酸、苯丙氨酸和莽草酸(图4)。

图4 第三阶段GN和ON果肉中蛋白质组和代谢组变化的通路图。红色的EC编号和箭头表示ON果肉比GN的上调;绿色的EC编号和箭头表示ON果肉比GN的下调;颜色代表相对值(log2(ON/GN)),比较ON和GN中检测到的每种代谢物的水平(红色:较高,绿色:较低)。缩写:G6P,葡萄糖-6-磷酸;F6P,果糖-6-磷酸;G3P,甘油醛-3-磷酸;PEP,磷酸烯醇丙酮酸;Pyr,丙酮酸;DXP,脱氧-D-木酮糖-5-磷酸;MEP,甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸;GGPP,香叶基丙基磷酸

改变的代谢物图谱概述显示,ON中丰度显著增加的代谢物富集了8条相关途径(图5A)。在ON中丰度显著降低的代谢物富集到9条相关通路(图5B )。富集最多的4条通路包括"丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢"、"苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成"、"精氨酸和脯氨酸代谢"和"酪氨酸代谢" (图5B )。基因型的代谢物谱显示,积累了大量类胡萝卜素的ON果肉中可溶性糖增加,氨基酸减少,表明苯丙类生物合成上调,初级代谢可能上调以参与类胡萝卜素的合成和加工。

5  改变的代谢物的代谢物图谱概述。AON中显著升高的代谢物富集的PathwayBGN中显著升高的代谢物富集的Pathway

2. 蛋白质组学数据揭示ON果肉中促进的碳水化合物代谢

为了深入了解初级代谢如何调控类胡萝卜素的生物合成,对S1、S2和S3的果肉样品进行了两组平行的定量蛋白质组学分析(图2)。在GN和ON果肉中分别鉴定到5355个和5949个特有蛋白,发现4699个蛋白为两种果肉共有(图S1 )。在果实发育过程中,对S3和S2的蛋白水平进行两两比较发现,ON果肉中的差异表达蛋白( DEP )比GN果肉中的多,表明从S2到S3,ON的代谢变化比GN更明显,这与类胡萝卜素积累的主要时期相对应。

此外,S3处ON和GN之间的DEP还富集在"丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢"、"缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解"、"赖氨酸降解"和"精氨酸和脯氨酸代谢"。如图4所示,这些结果也与上述代谢组结果高度一致。

图S1 GN和ON中鉴定到的蛋白质的Venn图。A、GN和ON中鉴定到的总蛋白。B、GN各发育阶段的蛋白。C , ON各发育阶段的蛋白

3. 类胡萝卜素生物合成相关蛋白及其等效类胡萝卜素生成基因在ON中的表达水平高于在GN中的表达水平

为了解释类胡萝卜素代谢的差异,该研究分析了类胡萝卜素生物合成途径中4个相关蛋白在2个基因型果肉中3个发育阶段的表达情况。DXR、GGPS、PDS和ZDS的蛋白丰度见图6。在果实发育过程中,4种蛋白在两个品种中均表现出增加的趋势。除GGPS在第一阶段( S1 )外,ON中的表达量均高于GN。

为了确认表达模式并研究蛋白和基因转录水平的关系,该研究进行了实时荧光定量PCR (qRT-PCR )分析。DXR、GGPS、PDS和ZDS在转录水平的表达模式与ON中的蛋白水平一致。在GN中,GGPS和ZDS在转录水平和蛋白水平都有相同的表达趋势,而DXR和PDS的基因表达水平呈现相反的趋势(图6)。

该研究除了分析的4个基因用于验证蛋白丰度外,还通过qRT - PCR测定了10个其他类胡萝卜素合成相关基因的表达水平(图6)。总体而言,ON果肉中类胡萝卜素合成相关基因的表达量相对高于GN。在ON果肉中,Psy2b的相对表达量在2期上调了近100倍(图6),这可能是ON类胡萝卜素含量较高的重要原因。

香蕉果肉类胡萝卜素途径基因表达和蛋白丰度曲线。蓝线,GN中相对表达量。红线,ON中的相对表达量。灰线,GN中蛋白质丰度

四、结论

综合结果表明,类胡萝卜素合成相关基因的上调表达和碳水化合物积累的增加有助于香蕉果肉中类胡萝卜素含量的提高。这可以从转录组、蛋白组学和代谢水平更全面地考虑香蕉果肉中类胡萝卜素的代谢,为提高香蕉中类胡萝卜素含量的育种或代谢工程策略提供帮助。

编辑:PS.H

审核:Tao Li

参考文献

Heng Z, Sheng O, Huang W, Zhang S, Fernie AR, Motorykin I, Kong Q, Yi G, Yan S. Integrated proteomic and metabolomic analysis suggests high rates of glycolysis are likely required to support high carotenoid accumulation in banana pulp. Food Chem. 2019 Nov 1;297:125016.

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