一、研究背景
二、研究手段
图1 技术路线
三、研究结果
1、研究流程及小鼠眼睛蛋白质-脂质鸟瞰
为探索小鼠眼睛的蛋白质脂质分布，对小鼠眼睛中获取进行蛋白质和脂质分布进行粗略观察。分离到小鼠眼睛中的角膜、房水、虹膜/睫状体、晶状体、玻璃体、视网膜、视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）/脉络膜、巩膜、视神经、眼肌和泪腺，共计11个组织学区域（图2 A）。多光子成像引导的显微解剖显示，视网膜、RPE/脉络膜、视神经、肌肉、泪腺具有较高的脂质表达，RPE/脉络膜中胶原蛋白和弹性蛋白也表现出较高的表达水平（图2B）。使用基于强度的绝对定量（Intensity-based absolute quantification,IBAQ）方法量化11个组织学区域蛋白丰度，后归一化为总比例（Fraction of total，FOT），允许在不同实验间进行比较（图2E）。
2.构建小鼠眼睛的区域分辨蛋白质组学图谱
为探究不同组织学区域的差异，对蛋白质组学进行表征和分析。11个组织学区域中共定量到13536个蛋白，计算所有组织中检测到的FOT值的中位数和最大值，并使用它们对11个区域的蛋白质表达模式进行密度图分析。根据此分析，将蛋白质划分为3类，即非普遍存在的蛋白(6722个)、普遍存在蛋白(2491个)和普遍存在的典型蛋白（223个）(图3A)。值得一提的是，普遍存在的典型蛋白发挥的生物功能主要包括代谢过程、定位、转运以及神经系统发育等(图3C)。转录因子(TFs)驱动从胚胎发育到癌变的各种生物过程，对本次在蛋白质组学数据中鉴定到的342个TFs进行研究，发现在泪腺、视神经和视网膜中发现了大量的区域特异性TFs，而在晶状体和房水中则相反(图3B)。结合TF下游靶基因数据库进行分析，发现Nfkb1和Ar在泪腺中占主导地位，是控制泪腺功能所必需。Foxc1和Stat3及其靶基因(Egfr, Jak2, Anxa1,C1s等)可维持角膜透明和内稳态，在角膜中过度表达。Hes1及其靶基因Glycam1在青光眼细胞迁移功能中起关键作用，主要在房水中被检测到(图3E)。对各组的特性蛋白进行KEGG富集分析，分析结果表明，过氧化物酶体、脂肪酸代谢和溶酶体相关蛋白在泪腺中富集。除泪腺外，房水、玻璃体和RPE/脉络膜也具有免疫相关通路的特征。而角膜、晶状体、玻璃体、视网膜和视神经具有强烈的视觉功能相关通路特征。在玻璃体中发现参与自噬、碱基切除修复和代谢途径的蛋白，一定程度上丰富了玻璃体的生物活性。视觉转导相关通路，如谷氨酸能突触、肌醇磷酸盐代谢和多巴胺能突触，在视网膜和视神经中富集。巩膜中关于代谢相关通路富集，表明有可能通过巩膜进行药物传递(图3D)。为深入地了解基因和眼部疾病之间的关系，将区域特异性基因与基因-疾病关联(Gene-Disease Associations，GDA)数据集进行匹配。干眼症、圆锥角膜、青光眼、白内障、黄斑变性、葡萄膜黑色素瘤、视神经障碍、眼肌麻痹等眼部疾病与不同眼区生理病理高度相关(图3E)。
3.小鼠眼睛MALDI-TOF成像和区域分辨脂质组学分析
为进一步对小鼠眼睛深入表征和分析，结合MALDI-TOF成像和脂质组学进行探究。眼睛是脂质含量较高的器官之一，这个说法在光谱结果中得到验证。使用MALDI-TOF成像系统（300-1300m/z范围)研究脂质的空间表达，主要涉及角膜、晶状体、视网膜、眼肌、视神经和泪腺，结果表明，通过脂质可成功区分不同结构(图4A,B)。成像结果表明，一些脂质在视神经和泪腺中高表达，如494.928,544.374m/z等；而视网膜和眼肌的脂质存在一定相似度，并且所有区域都存在一些脂质(图4C,D,E)。对4个眼睛区域进行脂质鉴定，共鉴定到3739种脂质，主成分分析表明，4个区域的脂质呈现明显的分离趋势(图4F）。进一步表征，发现甘油三酯(TGs)、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺(PEs)在小鼠眼睛脂质中占很大比例，此外，二酰基甘油(DAGs)、神经酰胺(Cers)、单己基神经酰胺(Hex1 Cers)等也占有一定比例，眼肌中存在相当多的心磷脂(CLs)(图4G,H）。对筛选得到的1678种差异丰富脂质进行分析，结果显示，视神经富含DAG、Hex1 Cers和固醇脂(STs)，泪腺中的TG和环磷脂酸(cPA)丰度升高。眼肌中TG、CLs和辅酶Q (CoQ)水平显著升高(图4J)。
图4 不同组织学区域MALDI-TOF成像和脂质表征
4.不同组织区域的蛋白质-脂质分析
为深入探究蛋白质组学和脂质组学的关联，进行蛋白质-脂质联合分析。将蛋白质组学中与脂质代谢相关的蛋白质进行聚类分析，泪腺中富集的通路涉及脂肪酸代谢、磷脂代谢和甘油磷脂代谢(模块5和模块3)(图5B)。VLCFAs蛋白(Elovl1、Elovl3、Elovl5和Elovl6)和过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶(Acox1、Acox2和Acox3)的丰度在泪腺中升高(图5C)。磷脂代谢和磷脂酰肌醇磷酸代谢相关蛋白在视神经中富集(模块1)，如磷脂酶C (Plcb4、Plcd3和Plch2)和磷脂酰肌醇磷酸激酶(Pi4ka、Pip4k2b、Pip5k1a和Pip5k1b)(图5B,C)。对含长链脂肪酸的TG、CLs、CoQs、cer和Hex1 Cers的差异丰度与其代谢相关的酶和激酶间的关系进行探究，结果显示，辅酶(Coq3、Coq5、Coq7、Coq9)蛋白表达与眼肌中CoQ6、Coq7、CoQ8、Coq9和CLs脂质丰度显著相关(图5D)。聚类和聚类特异性富集分析揭示了视神经、泪腺、眼肌和视网膜中起作用的主要脂质代谢途径和区域特异性蛋白-脂质关联。
图5 不同区域蛋白质-脂质分析
5.磷酸化蛋白组学是蛋白质-脂质组网络的验证
为验证区域特异性蛋白-脂质关联的发现，进一步量化了小鼠眼睛四个主要区域的磷酸化蛋白表达。Ras信号通路、钙信号通路在视神经中富集；泪腺中参与过氧化物酶体和脂肪酸代谢的磷酸化蛋白含量较高，柠檬酸循环(TCA循环)和氧化磷酸化相关的磷酸化蛋白在眼肌中含量丰富；视网膜中谷氨酸突触和突触囊泡循环通路丰富（图6A）。在眼肌中，Coq9在蛋白质组和磷蛋白质组学表现出丰度升高，过氧化物酶体生物发生因子(Pex1和Pex14)、酰基辅酶a氧化酶(Acox1和Acox2)和ATP结合盒亚家族D成员3 (Abcd3)在泪腺中蛋白质组学和磷蛋白质组学表达水平均上升（图6B）。进一步研究视网膜和视神经中的磷酸肌醇信号相关激酶，Pik3c2b、Pik3c3和Pip4k2a在视网膜中上调，这介导了磷脂酰肌醇3,4-磷酸(PI(3,4)P2)的形成，并在网格蛋白介导的内吞作用中发挥作用（图6B）。
图6 磷酸化蛋白组学验证蛋白质-脂质组网络
四、结论
区域分辨小鼠眼球蛋白质组和脂质组提供了一个生理学参考图谱，可能在临床应用中有用。多种生物信息学分析的结果能够更好地了解眼部蛋白的生物学功能、分子机制与疾病发展之间的关系，有助于获取眼部蛋白和脂类的生理学和病因学更全面的认识。
参考文献：
Xiang H, Zhang B, Wang Y, Xu N, Zhang F, Luo R, Ji M, Ding C. Region-resolved multi-omics of the mouse eye. Cell Rep. 2023 Feb 14;42(2):112121.
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