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H202传感器是拟南芥中的一种LRR受体激酶
标题:Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase
in Arabidopsis
期刊:Nature(19 January 2020)
第一作者:吴飞华(博士)
通讯作者:Zhen-Ming Pei
通讯地址:杜克大学
DOI:10.1038/s41586-020-2032-3
一.研究背景
动物植物面对各种非生物和生物胁迫→NADPH氧化酶/超氧化物歧化酶/其他机制促进eH202的生物合成→调节应激反应和生长发育。
(减数分裂、花粉管的生长、根毛生长、根干细胞生态位维持和脱落等)
eH202通过水通道蛋白进入胞浆,氧化细胞质。其中几种由H202共价修饰的蛋白质作为H202感受器。虽然离子通道和受体已经确定,但在细胞表明上是否存在eH202感受器是未知的。
eH202→胞浆Ca2+浓度增加→气孔关闭,猜测该通路参与eH202的感知和信号的传递,但分子机制未知。
二.生物学意义
①识别HPCA1作为eH202的传感器对于理解植物细胞内Ca2+的氧化还原是如何响应各种内外界刺激是至关重要的。
②在细胞表面上发现eH202感受器的意义重大:将内外部应力或信号转换成eH202的状态,从而触发统一优化的信号通路,避免全细胞的氧化还原。
③找到eH202感受器,可以为基因工程作物提供潜在的基因靶点,在生物或非生物逆境下增强抗逆性进和产量。
三.主要结论
基于Ca2+成像的前向基因筛查,在拟南芥中分离出了hpca突变体,证明HPCA1是一种富含亮氨酸的受体激酶,在胞外区域有两对多余的半胱氨酸残基,属于之前未注明的一个亚家族。HPCA1定位在质膜上,H2O2可以对其胞外的半胱氨酸残基进行共价修饰,使其活化,导致HPCA1胞内区域自磷酸化。在保卫细胞中,可以促进Ca2+通道的活跃,诱导气孔的关闭。
四.主要结果
1. hpca突变体的筛选
基于Ca2+成像的前向基因筛查,检测到了hpca突变体(常见方法未果)。利用全基因组重测序法,绘制了hpca的图谱(传统的定位方法未果)。其中hpca1现象最明显,它可以影响eH2O2信号的整体感知和转导。
(1)在甲磺酸乙酯诱变产生发光蛋白的M2代种子中,筛选4mM H2O2下[Ca2+]i
增加减弱的幼苗→分别检测两代,筛选出具有稳定表型的株系。
(2)hpca1/WT:hpca1在H2O2下[Ca2+]i增加减弱,但在形态或发育方面无差异。(图1a,b)
hpca1/WT:hpca1中Ca2+增加的高峰降低、对H2O2敏感度降低,但对山梨醇和NaCl敏感度一致。(图1c-h)
(3)hpca1/osca1/moca1相邻种植,hpca1不同于其他突变体,在H2O2不同处理下具有不同的表型。(附图2a-h)
2. hpca1保卫细胞中受损的eH2O2→Ca2+信号传导
(1)hpca1保卫细胞中,H2O2下,信号减弱,气孔关闭减弱。(图2a-d)
(2)WT保卫细胞原生质体中,H2O2下,Ca2+电流强。(图2e-g)
(3)hpca1中,在ABA→气孔关闭中存在明显缺陷。(图2h)
(4)hpca1比WT失水更快。(补充数据2i)
hpca1的保卫细胞中eH2O2→Ca2+以及ABA信号通路中存在缺陷
→hpca1中对eH2O2的感知存在缺陷
3. HPCA1编码一种LRR受体激酶
(1)对5个hpca家系进行全基因组重测序→3个hpca家系在同一基因上发生SNP→该基因编码LRR-RK(图3a)。
(编码受体激酶的基因是植物中最大的基因家族之一,LRR-RK是陆地植物中最大的受体激酶家族。)
(2)HPCA1属于Ⅷ-1亚家族,有8个功能未知的成员,都含有两对半胱氨酸残基,命名为过氧化氢区域(HP)。
(3)HPCA1可以弥补hpca1的表型→HPCA1是目标基因。(图3b,c)
(4)分析含有HPCA1启动子驱动的结构的转基因幼苗→HPCA1在子叶和保卫细胞中广泛表达,但在根尖较少。(图3d,e)
(5)【烟草瞬时表达】HPCA1蛋白定位在肿胀的等离子体化细胞的表面周围。(图3f)
{HPCA1在eH2O2信号传导中的作用}
(6)hpca1中,eH2O2诱导下,MAPK3和MAPK6(eH2O2的下游信号)的磷酸化程度降低,且在互补系中恢复。(附图7b)
{HPCA1是否特定于H2O2信号传导或还有其他LRR-RKs}
(7)(鞭毛肽flg22、延长因子EF-Tu延生肽elf18、elf26都是MAMPs(微生物表面共有的结构),可以诱导Ca2+增加)
fls2和efr(相应受体突变体) Ca2+不增加
hpca1 flg22和elf26诱导的Ca2+增加不影响
fls2和bak1 和WT的eH2O2信号传导水平一致
ghr1 eH2O2诱导的Ca2+增加不受影响
在保卫细胞eH2O2信号通路中有多个LRR-RK受体,
其中HPCA1或许是GHR1的上游感受器
4. eH2O2激活HPCA1激酶
{证明HPCA1激酶活性的必要性}
(1)蛋白激酶抑制剂K252a抑制[Ca2+]i增加,减弱Ca2+电流,抑制气孔关闭。(图3h,i)
(2)HPCA1-YEP hpca1-2 随着H2O2处理浓度的增加,HPCA1磷酸化程度增加(图3j)
{HPCA1CD域是否具有激酶活性或作为一个支架}
(3)HPCA1(K695E)CD、HPCA1(D773L)CD、HPCA1(Q856*)CD ×
HPCA1CD MBP可自磷酸化和磷酸化→蛋白迁移率改变
HPCA1CD +γ蛋白磷酸酯酶 ×
(图3g,k)
(4) HPCA1 hpca1-2 √
HPCA1(K695E)hpca1-2 ×
HPCA1(D773L)hpca1-2 ×
HPCA1(Q685*)hpca1-2 × (图3l)
(5)【质谱法】
H2O2→Thr786, Thr789, Thr790, Ser606, Ser607 和Ser942 磷酸化程度增加(其中Thr786, Thr789, Thr790在保守催化子域之间)
eH2O2激活HPCA1激酶活性,导致HPCA1自磷酸化,传递信号至下游
5. H2O2氧化HPCA1的胞外半胱氨酸残基
(半胱氨酸硫醇—H202→硫酸+SO2=氧化剂信号→动态生物反应的分子开关)
{HPCA1HP上的半胱氨酸残基是否可被H2O2修饰}
Ca2+电流 | WT | hpca1 |
IA-biotin | × | × |
MTSEA-biotin | 有\无 √ H2O2处理 | × |
(1)
(试剂处理后30min内没有形成电流)
(图4a-d)
→HPCA1的胞外Cys要形成二硫键,促进CA2+电流的形成
→胞外Cys或许是eH2O2的感受位点
{Cys残基对于eH2O2感应的必要性}
(3)hpca1-2 ×
HPCA1 hpca1-2 √
HPCA1(C421S/424S) hpca1-2 ×
HPCA1(C434S/436S) hpca1-2 ×
HPCA1(4C/S) hpca1-2 × (图4e,f)
{胞外Cys残基是否处于还原状态,可被氧化}
(4)HPCA1-YFP hpca1-2 中的Cysred含量比HPCA1(4C/S)-YFP hpca1-2 重的更大,Cysred含量随着H2O2的增高而减少(图4g)
→这四种Cys残基在胞外以还原态形式存在,在体内被H2O2氧化
{确定胞外Cys被氧化}
(5)H2O2→Cysox增加 (图4h-j)
eH2O2共价修饰HPCA1胞外的Cys残基,作为eH2O2的感应机制,
激活HPCA1的激酶活性,打开Ca2+通道
五.主要方法
基于发光蛋白质的Ca2+成像、对hpca的遗传筛选、光谱学、基于YC3.6的Ca2+成像、气孔孔径和密度生物测定、保卫细胞电生理、全基因组重测序定位、系统进化分析、组织化学GUS活性分析、亚细胞定位、重组蛋白纯化及激酶测定、免疫印迹分析、质谱分析
六.讨论
①细胞外空间处于氧化状态,并且暴露在细胞外的蛋白质在向质膜的运输过程中被氧化,如何产生或维持HPCA1胞外Cysred以防止构成性激活传感器,以及eH2O2的Cysox是如何再生和还原的分子机制尚待确定。
②除了GHR1,富含半胱氨酸的受体样激酶也在eH2O2的传感和信号传递中起作用。但是,它们在eH2O2 Ca2+信号中的作用尚未确定。
③包括HPCA1在内的受体激酶下游的 Ca2+通道的分子机制还未知。
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