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Nature突破!可爱龙实验室揭示CRISPR-Cas系统Prespacer方向性整合机制 精选

已有 2976 次阅读 2021-9-30 09:12 |个人分类:小柯生命|系统分类:论文交流

北京时间2021年9月29日晚23时,国际权威杂志《自然》发表了美国康奈尔大学可爱龙实验室题为“Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR-Cas”的研究论文。


该工作报道了Cas4蛋白识别PAM的分子机制,以及其协助Cas1-Cas2对spacer前体Prespacer(或ProtoSpacer)进行方向性整合的分子机制。


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CRISPR-Cas系统是来自于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。类似于高等动物的细胞免疫过程。首先是CRISPR系统中的Cas1-Cas2复合物捕捉外源入侵DNA序列(如图中的噬菌体),将其整合到CRISPR Array当中去,该步骤被称为Adaptation,好比是搜集入侵者信息。然后CRISPR Array会被转录为RNA序列(pre-RNA),经过Cas蛋白加工成为较短的、成熟的指导RNA(guide RNA),再与效应器(Cas9, Cas12, Cas12, Cascade等)结合成为具有靶向功能的复合物,该过程可以形象理解成是给导弹制导。最后当该序列的外源性DNA再次入侵时,效应器会迅速靶向,从而对入侵物进行精准打击,达到定点消除的目的。


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在整个CRISPR-Cas领域中,靶向功能复合物的组装(导弹的制导)和定点切割外源核酸(精准打击)这两步已经研究比较多,利用这两点,基于CRISPR-Cas的基因编辑工具已经风靡全世界。然后第一步,如何搜集外源DNA信息,还有诸多疑点未解析清楚。虽然以前有很多顶级期刊已经报道了一些有关Cas1-Cas2是如何整合外源DNA的,比如中国科学院生物物理所王艳丽研究员于2015年发表于Cell,报道了Cas1-Cas2如何识别PAM序列(1);美国加州大学 Jenifer Doudna实验室也通过Nature长文也表达了类似观点。以及2017年几乎同期发表的NatureScience的文章,分别报道了来自可爱龙研究组和Jennifer Doudna研究组关于Cas1-Cas2如何整合Prespacer进入CRISPR Array的分子机制。然Cas1-Cas2整合Prespacer进入CRISPR Array是具有方向性的,在Type I CRISPR-Cas系统之中,PAM链是滞后整合进入Repeat-Spacer端(2)(如下图所示),然而到目前为止其分子机制还不清楚。

 

2018年以来陆续有众多研究工作开始报道,Cas4对Prespacer的选择、加工以及方向性整合非常关键。同时Cas4在绝大部分的CRISPR-Cas系统中都能找到,这暗示了Cas4具有非常重要和保守的功能。然而因为Cas4是一种Fe-S cluster(铁硫簇)家族核酸酶,Fe-S对氧气异常敏感,因而很难拿到性质稳定具有活性的样品,因此Cas4相关的分子机制研究一直是一项难点。

 

美国康奈尔大学可爱龙教授和其实验室胡纯一博士等人,以及Stan J J Brouns团队,使用GsCas4-Cas1融合系统,在尝试众多纯化策略之后,最终在厌氧条件下获得了性质稳定均一,具有活力的Cas4-Cas1蛋白。再通过筛选底物,获得了均一的复合物,再结合冷冻电镜,解析了其3.1埃分辨率的复合物结构。该结构首次揭示了在Cas4共存的系统之中是由Cas4识别PAM序列,而不是由之前被认为的由Cas1负责识别PAM。


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之后团队继续解析了Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer_PAM/Non PAM复合物结构。发现在这种不对称的结构中,Cas4会释放Non-PAM端,保护住PAM端。从而Non-PAM端被暴露给内源核酸酶进行迅速切割。而PAM端被Cas4保护从而无法被切割,这揭示了PAM端滞后整合的分子基础(如下图)。


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以上工作解释Cas4识别PAM协助Cas1-Cas2捕捉外源DNA的分子机制,以及Non-PAM端先行切割的机制。然而还是无法完全解释Prespacer方向性整合问题。可爱龙团队通过高分辨率结构得知完整的复合物中Cas4虽然结合底物以及金属离子,然后其并未切割PAM而只是识别结合。在此基础之上,团队继续解析了一系列Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer-Target DNA半整合以及全整合结构,通过结构和生化分析,揭示了在Non-PAM端被ExoI快速加工后会迅速被整合进入CRISPR Array的Leader-Repeat端,从而形成半整合状态。在此半整合状态下,一段突出的DNA序列会结合Cas4-Cas1蛋白一块正电荷富集区,然后推动Cas4高效切割PAM,切割完成后Cas4会将末端传递给Cas1整合酶活性中心完成全整合过程(如下图所示)。

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总之,该项研究首次报道了CRISPR-Cas系统中,Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制,此外通过一系列结构生物学和生化方法揭示了Cas4调控的Prespacer方向性整合的一整套分子机制。


这项工作,为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作,尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释,最后附上整个Cas4系统运行机制的模式图。


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可爱龙教授本科毕业于中国科技大学,后于美国攻读博士学位。之后在Jenifer Doudna实验室做博士后研究工作。此后十余年都是主攻RNA相关领域的分子机制,包括核酶(Ribozyme)和CRISPR-Cas。在这两个领域都取得了十分喜人的成绩。近6年,发表众多佳作,其中包括以通讯作者已经于Nature发表论文3篇,Cell发表论文2篇(一篇perspective),Science发表论文1篇,Mol cell发表论文3篇(一篇comments),NSMB发表论文2篇,Nature communications发表论文1篇等等,是一位不可多得的高产又高质量的顶级学者。


可爱龙实验室目前有博士后职位提供,有意者请联系:ailong.ke@cornell.edu

 

相关论文信息:

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03951-z

 


参考文献

1Wang, J. et al. Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems. Cell 163, 840-853, doi:10.1016/j.cell.2015.10.008 (2015).

2Jackson, S. A. et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science 356, doi:10.1126/science.aal5056 (2017).




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1 黄永义

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