如何实现微生物中心代谢网络代谢流的最优分配一直是高版本微生物底盘细胞构建的研究热点之一。

基因回路目前被广泛应用于代谢网络的动态控制，其可以有效避免有毒中间代谢物的积累，平衡细胞生长与产物合成的代谢流，从而提高产物的合成效率。

刘龙介绍，这些基因回路大多通过响应外界环境信号、中间代谢物和信号分子发挥功能。然而，目前缺乏能够响应胞内关键中心代谢物的基因回路，例如丙酮酸。

丙酮酸是连接细胞糖酵解途径与三羧酸循环的关键中心代谢物，其一方面为产物的合成提供碳骨架，另一方面进入三羧酸循环为细胞生长提供能量与还原力。因此，构建响应胞内丙酮酸浓度的基因回路能够进行碳中心代谢流的动态控制，促进中心代谢衍生产物的高效合成。

本研究基于大肠杆菌来源的丙酮酸响应转录因子PdhR，在B. subtilis中设计、构建了丙酮酸响应基因回路，进一步通过突变以及改变PdhR在启动子上的结合序列与位置，优化了丙酮酸响应基因回路的动态范围，最后测试了所构建基因回路的正交性和响应阈值。

图1 基于PdhR的丙酮酸响应基因回路的构建和特性

然而，获得的基因回路都为丙酮酸激活型的回路，为构建丙酮酸抑制型的基因回路，需要在基因回路中引入“非”门，实现正负信号的转换。

反义转录是生物界中普遍存在的基因表达调控方式，其通过形成反义RNA以及转录干扰影响正义链编码基因的表达。相对目前常用的sRNA和CRISPRi调控系统，反义转录并不需要在细胞中引入异源的调控蛋白且能够同时发挥顺式与反式的调控功能，因此具有更好的潜在应用前景。

研究人员首先验证了反义转录在枯草芽孢杆菌中的功能，并结合实验数据以及模型预测，发现转录干扰是反义转录发挥功能的主要机制，并揭示活性越强的启动子越容易因为“自闭塞效应”而受到转录干扰的影响。

此结果意味着反义转录的调控元件不需要在质粒上进行表达，既能够通过顺式作用的方式有效的调控目的基因的表达。随后，研究人员结合反义转录以及高通量筛选技术，成功获得丙酮酸抑制型的基因回路。从而获得受胞内丙酮酸诱导的双功能基因回路。

图2 枯草芽孢杆菌中反义转录调控作用的功能测试

最后，研究人员利用双功能的丙酮酸生物传感器设计反馈控制系统，该系统使细胞能够自发地响应胞内丙酮酸浓度，动态优化B. subtilis中心碳代谢途径的代谢流，从而使B. subtilis高效合成葡萄糖二酸。

通过动态下调糖酵解途径中的pgi基因，戊糖磷酸途径中的zwf基因和动态上调葡萄糖二酸合成途径中ino1基因的表达，葡萄糖二酸的摇瓶产量提高了154%，而传统的静态调控策略仅提高35%。

动态调控菌株中的丙酮酸含量出现了振幅式变化，证明所建立的反馈回路成功动态控制了B. subtilis的中心碳代谢途径。

图3 枯草芽孢杆菌中葡萄糖二酸合成的动态调控

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DOI：10.1038/s41589-020-0637-3