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论文赏析:多靶点粪便DNA甲基化检测在中国人群结直肠癌筛查中的价值分析

已有 1116 次阅读 2021-7-23 14:59 |系统分类:论文交流


论文赏析:

多靶点粪便DNA甲基化检测在中国人群结直肠癌筛查中的价值分析

影响因子4.207

image.png 


本文报道一种基于粪便样本的4靶标甲基化检测试剂结直肠癌的临床性能评价结果。作者重点分析了4个靶标的不同甲基化阳性判断方法(1/4、2/4、3/4和4/4)对评价结果的影响。

阳性算法

样本阳性判断

靶基因阳性判断

1/4

4个标记物中有1个是阳性

阳性对照Ct值≤ 25;阴性对照无扩增或Ct值>38,样本靶标Ct值≤38为阳性

2/4

4个标记物中有2个是阳性

同上

3/4

4个标记物中有3个是阳性

同上

4/4

4个标记物中有4个是阳性

同上

备注

如果靶基因35<Ct值≤ 38需要重复实验

一、材料和方法

1、临床样本收集

本研究共收集结肠癌患者62例、结肠腺瘤71例、正常146例,总样本数共279例,详见表1。

1、测试样本临床特征

image.png

Polyp size——息肉大小;

Adenoma classification---腺瘤分类(管状47、管状绒毛状14,绒毛状11)

 

2. 荧光定量PCR信息

粪便样本

25-100g

检测靶标

SNCA、SPG20、Septin9和FBN1

内标基因

ACTB(β-actin)

阳性对照

甲基化DNA

阴性对照

非甲基化DNA片段

引物设计

为Septin9、SNCA、SPG20和FBN1没有CpG双碱基的区域设计了PCR引物

阻滞剂

在没有甲基化的序列区域设计了阻滞剂,使甲基化序列在亚硫酸盐转化后优先扩增。

DNA提取


亚硫酸盐转化DNA


qMSP分析


 

3、结果判断与解释

阴性对照

无扩增,继续分析否则,实验无效

阳性对照

有扩增,Ct值≤ 25,继续分析

阳性对照扩增Ct值≤ 38

继续分析

阳性对照Ct值>38

不继续分析实验失败

样本出现扩增,Ct值≤35

样本为阳性

样本未发现扩增,或Ct值>38

样本为阴性

如果35<Ct值≤ 38

需要重复实验

重复试验仍35<Ct值≤ 38

则样本为阳性

 

3.统计分析

计数数据

卡方检验或Fisher精确检验

计量数据

均数±标准差表示,采用t检验

标记基因的临床价值

受试者操作特征(ROC)分析

金标准数据

结肠镜检查

指标

敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值

 

二、结果与分析

2是不同样本类型中4个靶标甲基化检测阳性率数据及其差异显著性测定结果。四个基因的甲基化阳性率都随着病程加重而加大(肠癌>腺瘤>正常)。

image.png 

 

3、不同靶标的临床表现——4个标记物中只要一个为阳性时判为阳性

image.png 

4、不同靶标的临床表现——4个靶标中有2个为阳性时判为阳性

 

image.png

 

5、不同靶标的临床表现——4个靶标中若3个或4个为阳性时判为阳性

 

image.png 

结论:随着甲基化阳性标记物数量的增加,特异性随之增加,灵敏度随之降低甲基化检测的敏感性和特异性优于传统粪便隐血测试,可用于结直肠癌筛查和辅助诊断。

 

评论:

肿瘤甲基化检测试剂盒的临床试验评价一般采取ROC曲线分析的方法。本例中,ROC曲线分析用来评判样本的甲基化检测结果与金标准检测结果的符合程度,输出AUC值,特异性和敏感性。样本的甲基化检测结果用阴性或阳性来表示。如何得出这个阴性还是阳性需要基于特定的算法。

关于甲基化水平的算法,如果是单个靶标,甲基化水平可以表示为Ct值,或ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt  2-△Ct等等方法(计算方法见下表)。本文采用的是Ct值,并将阳性截断值定为38,即小于38为阳性,大于38为阴性,但文章没有提到阳性判断值Ct来自何处,有何依据。

 

单靶标甲基化水平

公式

Ct

Ct 或 阳性判断值-Ct

ΔCt

Ct靶标-Ct内标

ΔΔCt

(Ct靶标-Ct内标)样本-(Ct靶标-Ct内标)阳性对照

甲基化水平

2-ΔΔCt 或 2-△Ct

PMR

10000*2 (Ct内标-Ct基因)

QMSP

10000*目的基因甲基化DNA量/内标基因甲基化DNA量

阳性判别模式

1/2,1/3,2/3

对于多个靶标,样本的甲基化水平需要整合不同靶标的结果,因此涉及不同的算法。一类为简单算法(如1/n,2/n,3/n,4/n,1/n表示n个靶标中有1个为阳性时样本判为阳性,以此类推)。更多的情况下采取Logistic回归或随机森林等方法进行分析和建模。

本文直接使用靶标Ct值表示样本靶标基因的甲基化水平,没有考虑内标ACTB的Ct值(甚至没有讨论),因此忽视了PCR过程中内标基因的质量控制作用。



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