文献来源: DNA methylation biomarkers in stool for early screening of colorectal cancer. J Cancer. 2019 Aug 28;10(21):5264-5271

1、研究目的

本研究通过探讨粪便样本中Sept9、BMP3、NDRG4和SDC2基因的甲基化状态，及其与结直肠癌的关系，筛选出诊断结直肠癌有效的甲基化检测标记物。

2、技术路线   

 3、材料与方法

从癌症患者和非癌症患者大便及结直肠癌组织中分离纯化DNA。用甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）对SEPT9、BMP3、NDRG4和SDC2的基因甲基化水平进行定量。获得不同基因的Ct值后，计算它们的甲基化水平M=2^{（∆Ct参考基因-∆Ct目标基因）}。利用不同基因的甲基化水平数据按照不同基因组合拟合成二元logistic回归模型（glm包，R），建立诊断模型。对于单基因标记，用目的基因和参考基因ACTB进行拟合。通过Youden的J指数确定最优阈值。为了验证模型的有效性，将整个队列随机分为两部分： 训练队列（60%）和测试队列（40%）。训练队列用于模型的建立，测试队列用于模型的性能评估。

统计分析

4、结果与分析

4.1 组织样本甲基化检测

图1、结直肠癌组织样本中四个基因的甲基化水平分布

qMSP检测正常组织（Norm）、癌旁正常组织（NAT）和肿瘤组织（tumor）获得的甲基化水平分布图。（a）不同基因的Ct值箱线图。（b）不同基因的甲基化水平分布图。均显示，SEPT9、NDRG4和SDC2的甲基化水平是肿瘤组织极显著高于正常组织。但BMP3基因这种趋势不显著。

4.2 粪便样本甲基化检测 

图2 粪便样本检测结果

a图是不同基因在正常人、腺瘤患者及癌症患者之间甲基化程度比较。b和c图分别是腺瘤患者和大肠癌患者粪便甲基化检测结果的韦恩图，显示不同标记物检测结果的符合程度。

图3 不同基因的诊断性能测试（粪便标本）

利用单个基因和四个基因组合（组合4）或三个基因组合（组合3）进行诊断，绘制出训练队列（a）和测试队列（b）的ROC曲线。（c）图是联合测试模型4中每个基因的效应。（d）图是联合测试模型4和联合测试模型3的参数比较。

图5、大便样本DNA检测模型在结直肠癌和腺瘤中的诊断价值评价：（a）正常人与腺瘤患者（Ade）或CRC患者的ROC曲线。（b）腺瘤患者（Ade）或CRC患者样本的AUC值及其诊断敏感性。

五、结论

SEPT9、NDRG4和SDC2基因的DNA甲基化状态对大肠癌具有显著的诊断价值，而BMP3没有显著的诊断价值。此外，SEPT9、NDRG4和SDC2甲基化的联合检测结直肠癌和腺瘤具有高度可行性，对结直肠癌的检测效果优于腺瘤。粪便标本中SEPT9、NDRG4和SDC2的甲基化状态可作为大肠癌早期筛查的潜在生物标志物。