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Dev Cell | 四川大学卢克锋/许文明团队揭示生殖组织特异性自噬重要生理功能

已有 257 次阅读 2021-10-8 09:15 |系统分类:科研笔记

自噬(Autophagy)是细胞质成分大量运输和降解的分解代谢循环途径,在各种生理和病理条件以及神经退化性疾病中起着关键作用。精子发生从精原细胞历经减数分裂成为圆形精子细胞,然后经历一系列的形态变化和功能转变,形成伸长的成熟精子。在精子的发生过程中,除了精子鞭毛的配置和顶体的发生等过程,另一个重要变化就是精子中的多余细胞器和细胞质的去除。在精子发生过程中,自噬起始是如何被调节的以及这种调节的功能意义是什么尚不清楚。


近日,来自四川大学卢克锋、许文明团队在专业学术期刊Developmental Cell上发表了题为 “Autophagic elimination of ribosomes during spermiogenesis provides energy for flagellar motility” 的研究长文。研究人员发现Vac8/ARMC3调节自噬的上游步骤和自噬体的形成。通过蛋白质组学分析表明,在缺乏ARMC3的小鼠精子细胞中,细胞质核糖体的自噬降解被阻断,导致线粒体能量水平低和精子鞭毛运动力丧失。该研究揭示了Vac8/ARMC3在PtdIns3P激酶复合体锚定在自噬起始位点的作用,以及其在生殖组织特异性自噬中的重要生理功能。景杰生物为该研究蛋白质组学定量提供技术支持。

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01
Vac8调节自噬的上游步骤和自噬体的形成

在酿酒酵母中,含有ARM结构域的液泡膜蛋白Vac8通过其N末端的肉豆蔻酰化和/或棕榈酰化整合到脂质双层中,在细胞自噬中发挥重要作用,然而Vac8在自噬中的作用机制尚不清楚。为了验证Vac8在自噬中的重要作用,研究者分别在WT、Atg1Δ和Vac8Δ酵母细胞中过表达GFP-Atg8融合蛋白,通过GFP切割实验,发现Vac8缺失与Atg1缺失所导致的结果相似,均明显阻止了自噬的发生(图1 A)。此外,通过免疫荧光实验,发现Vac8的缺失阻止了自噬体的形成(图1 G)。这些数据表明Vac8对于自噬至关重要,且调节自噬的上游步骤,并促进自噬体的形成。

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图1 Vac8对自噬至关重要

进一步研究发现,当Vac8的棕榈酰化位点C4,5突变为A后,突变体Vac8-C4,5A蛋白不仅失去了液泡膜定位,且不能恢复Vac8缺失细胞中的自噬发生(图2 D-E)。这些结果表明Vac8(主要是C4,5)的棕榈酰化介导了其液泡膜定位及其在自噬中的功能。

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图2 Vac8的棕榈酰化决定了它的定位和自噬功能


02
Vac8的棕榈酰化促进PIK3C3-C1募集和PtdIns3P生成

通过免疫沉淀和随后的质谱分析研究鉴定了Vac8相互作用蛋白,发现III类PtdIns3-激酶复合物I (PIK3C3-C1) 亚基Vps15、Atg14、Atg6/Vps30和 Vps34与Vac8具有最强的结合能力(图3 A-B)。coIP实验也证实Vac8确实与PIK3C3-C1相互作用(图3 C)

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图3 Vac8与PIK3C3-C1复合物相互作用

免疫荧光结果显示PIK3C3-C1的四个亚基分别位于液泡膜,并与Vac8蛋白共定位。此外,PIK3C3-C1亚基的液泡膜定位在Vac8缺失的酵母细胞中被完全破坏并发生局部扩散(图4 A)。Vac8的外源表达恢复了PIK3C3-C1亚基的定位,但其棕榈酰化突变体或ARM域缺失突变体不能(图4 B)。紧接着,研究人员利用PI3P-sensor去检测细胞中的PtdIns3P。结果发现,在WT酵母细胞中,PtdIns3P位于液泡膜周围,而Vac8的缺失导致PtdIns3P的弥散定位(图4 C)。功能回复实验显示,在Vac8缺失的细胞中,外源表达Vac8可以恢复PtdIns3P的液泡膜定位,但其棕榈酰化突变体或ARM域缺失突变体不能(图4 E)。以上数据证明Vac8的棕榈酰化和ARM结构域对于将PIK3C3-C1复合物募集到液泡膜和PtdIns3P生成至关重要。

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图4 Vac8的棕榈酰化和ARM结构域促进PIK3C3-C1复合物的募集

03
Vac8同源蛋白ARMC3,在精子发生的自噬中起作用

通过基于序列同源性算法的生物信息学分析,发现Vac8的哺乳动物同源蛋白ARMC3,在成年小鼠睾丸中高度表达(图5 A-C)。为了研究ARMC3在体内的分子功能和机制,研究人员在小鼠的睾丸组织中利用coIP实验,发现在WT小鼠中,ARMC3与PIK3C3-C1亚基(VPS34、VPS15、Beclin1和ATG14)具有相互作用(图5 D)。电镜、免疫荧光等一系列生化实验证实ARMC3的缺失会造成小鼠精子细胞自噬体无法形成、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞) PtdIns3P的缺陷和自噬流被阻断等现象(图5 E-I)。此外,与野生性ARMC3相比,ARMC3的棕榈酰化位点C507A/C518A突变体不能挽救ARMC3-/-小鼠MEF细胞的自噬流。这些数据表明了ARMC3的棕榈酰化对小鼠睾丸的自噬十分重要。

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图5 Vac8的哺乳动物同源蛋白ARMC3,在小鼠睾丸的自噬中起作用

04
蛋白质组学技术揭示了ARMC3-/-小鼠精子低活性的机制

研究人员发现,与WT鼠相比,ARMC3-/-雄性小鼠完全不孕,且精子活力显著降低(近静止状态)。为了探索这种不育的原因,研究者利用TMT标记的蛋白质组学方法(质谱策略)分别分析WT和AMRC3缺陷的小鼠精子(样本策略)。总共量化了4378种蛋白质,且在ARMC3-/-小鼠精子中定量了327种上调蛋白质和539种下调蛋白质(图6 I)在上调的蛋白质中,发现核糖体蛋白明显且特异地富集(图6 J),28个核糖体亚基在ARMC3-/-精子中被上调,而没有一个被下调(图6 K),免疫印迹进一步证实了ARMC3-/-精子中核糖体亚基上调的模式(图6 L) 。这些结果加强了关于ARMC3参与的自噬在从圆形到细长精子细胞的过渡过程中发挥降解作用的推测,并且通过自噬去除过多的细胞质原料(如核糖体)为精子细胞中的线粒体提供了能量资源。


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图6 ARMC3-/-小鼠表现出雄性不育和核糖体蛋白的积累


自噬过程的一个特点是从无到有的形成自噬体来包裹底物并运送到溶酶体/液泡进行降解。在自噬研究领域,自噬起始(空间上和时间上)是如何被调节的以及这种调节的功能意义是不清楚的。该研究发现酵母蛋白Vac8将自噬体脂质PtdIns3P的催化激酶复合体PIK3C3-C1募集到自噬体组装位点来介导自噬起始,并发现了Vac8的哺乳动物同源蛋白ARMC3,揭示了Vac8/ARMC3在 PtdIns3P激酶复合体锚定在自噬起始位点的作用,以及其在生殖组织特异性自噬中的重要生理功能。这项研究表明,在多细胞生物中,在某些情况下,特别是当细胞突然需要增加新陈代谢时,自噬被激活以降解胞内物质从而满足细胞自主方式的物质和能量需求


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Graphical abstract



参考文献

Chang-Jun Li, et al.,2021, Senescent immune cells release grancalcin topromote skeletal aging. Cell Metabolism.





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