蛋白质磷酸化是生物体中较常见的一种蛋白质翻译后修饰方式，它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，所以磷酸化一直是生物学研究的重点与热点。但是基于DDA分析的定量磷酸化蛋白质组学正面临着检测通量和定量稳定性等方面的突破。虽然DIA技术的发展，提供了更为稳定的定量结果，但是其应用于磷酸化等修饰组学检测一直比较困难。这一困难的核心，在于谱图解析的困难，不但需要预先建立参考库，而且在修饰位点的错误定位问题上也没有很好的解决方式。

2020年2月，哥本哈根大学Jesper Olsen在国际专业学术期刊Nature Communications报道了一种快速且稳定实现磷酸化高通量分析的方法——基于directDIA的高深度定量磷酸化蛋白质组学。在该研究中，使用directDIA方法可以不用预先建立参考库，拥有更加准确的定位信息，并且可以在15min的短梯度内鉴定超过20000个磷酸化肽段，极大提高了磷酸化检测的通量、深度和平行性。

1、DDA和DIA、dDIA定量磷酸化蛋白质组学深度的比较

在本文中，作者应用DDA的最佳实验方法，即15分钟LC-MS/MS梯度进行后续对比，分别鉴定出DIA洗脱组前体和磷酸肽的数量分别是DDA肽谱匹配和磷酸肽数量的三倍（图1b），且DIA显示重复之间的磷酸肽鉴定有明显更高的overlab（图1c，d），DIA的相关系数R2为0.93，而DDA的R2为0.89，也表明DIA的定量重复性更好（图1e，f），同时，量化差异也揭示出DIA测得碎片离子数比DDA高出约六倍（图1h）。

4. DIA 独特的磷酸化位点定位算法

在标准DIA分析期间，该算法通过对库中肽前体的所有潜在峰的检测和分类开始。只将修饰的肽作为候选位点，动态的表明所有可能的位点组合，该算法会计算并保留唯一的片段质量，然后与单个位点候选片段匹配，从而将每个片段标为确认或否定的一个特定位点候选片段（图4a） 。再结合质量精度和XIC相关性的各个碎片离子匹配，为每个候选位点计算得分后，将支持该位点的所有片段分数的和减去所有否定该位点碎片分数，来计算最终分数（图4b）。

为评估PTM位点定位算法的性能，建立适当的位点可信度得分临界值以进行准确的位点定位，作者在具有已知位点定位的合成磷酸肽库中进行了测试（图4c）。结果表明，低稀释度严重阻碍了DDA鉴定磷酸化位点的数量，而DIA在所有稀释液中均保持较高的识别率，这进一步证实了DIA的灵敏度和动态范围均优于DDA，且磷酸化位点分配的错误率更低（图4d,e）。

图4 DIA磷酸化PTM位点定位算法

综上所述，本文主要是基于DIA对磷酸化蛋白质组学的工作流程进行改进优化，开发了PTM位点定位算法打分评估作为DIA计算的一部分，以此作为对基于DDA的最新磷酸化蛋白质组学的基准。通过分析合成磷酸肽，具有生物复制的激酶抑制剂与EGF刺激的细胞相匹配的文库，显示了基于DIA特别是dDIA的磷酸化蛋白质组的准确性，特异性和高深度。患者肿瘤的磷酸化蛋白质组学谱的分析可能更有利于未来精准医学的研究。

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参考文献

1.Dorte B. Bekker-Jensen, et al., 2020, Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries. Nature Communications.

2.Peckner, R, et al., 2018,Specter: linear deconvolution for targeted analysis of data-independent acquisition mass spectrometry proteomics. Nature Methods.

3.Searle, B. C, et al., 2019, Thesaurus: quantifying phosphopeptide positional isomers. Nature Methods.

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