作为中枢免疫器官，胸腺是T细胞发育和成熟的必须场所。胸腺上皮细胞（Thymus epithelial cell;TEC）是胸腺中重要的基质细胞，其突起相互连接而形成网状结构，在胸腺细胞分化、发育和选择过程中发挥重要作用。TECs根据在胸腺的位置不同，可分为两群：皮质上皮细胞 (cTECs)分布在胸腺外围皮质部分，髓质上皮细胞(mTECs)分布在胸腺中心髓质部分，分别介导胸腺细胞的阳性选择和阴性选择。这些选择过程将保证最终发育成熟的T细胞既具有识别自身MHC分子限制性抗原又对自身抗原耐受的特性。蛋白质组分析在深入了解细胞发育和功能的分子基础方面展示了其强大的优势。然而，TECs及其亚种群详细的蛋白质组分析数据尚未报道。

近日，美国国立卫生研究院国家癌症研究所实验免疫学分会Yousuke Takahama等人在国际著名学术期刊Cell Reports上发表标题为Trans-omics Impact of Thymoproteasome in Cortical Thymic Epithelial Cells论文，利用转录组学、蛋白组学等技术揭示了cTECs和mTECs之间的发育和功能差异的特征分子，及胸腺蛋白酶体对皮质胸腺上皮细胞功能影响。

在本研究中，作者使用了胸腺增大的转基因小鼠来克服用于蛋白质组分析的TECs数量有限这一问题。对从转基因小鼠中分离的cTECs和mTECs进行RNA测序分析和基于质谱定量蛋白质组学研究，揭示了导致cTECs和mTECs之间发育和功能差异的特征分子基础。研究同时发现β5t对于cTECs中蛋白酶体亚基的组成具有高度特异性影响，从而支配cTECs中CD8 + T细胞的发育。

文章主要结论与亮点

1. K5D1转基因小鼠，获取免疫活性及自我耐受的T细胞

2. K5D1小鼠来源的cTECs和mTECs 蛋白组学与RNA-Seq分析

3. β5t敲除cTECs中蛋白酶体组分发生变化

1、K5D1转基因小鼠，获取免疫活性及自我耐受的T细胞

为了克服用于蛋白质组分析的胸腺上皮细胞（TECs）数量有限这一问题，研究者使用胸腺增大的K5D1转基因小鼠。角蛋白5（keratin 5）启动子可促进表皮及胸腺显著增生。重要的是，增大的胸腺仍然维持着髓皮质结构以及产生T细胞的能力，但其TEC数目大约是同龄正常小鼠的80到100倍。研究者用流式细胞仪检测等方法证实K5D1转基因小鼠胸腺细胞的数量增加，接近正常小鼠的30- 50倍，而其cTECs及mTECs标志分子的表达情况与正常小鼠相似，CD4/CD8和TCRβ/TCRδ的分布也没有明显的变化（图1A、B）。结果表明，K5D1小鼠胸腺能够产生和选择功能正常及自我耐受性T细胞，其cTECs和TECs可作为生物化学分析，包括对细胞需求量比较大的蛋白质组学分析。

图1. K5D1胸腺产生功能正常和自我耐受的T细胞

2. K5D1小鼠来源的cTECs和mTECs 蛋白组学与RNA-Seq分析

研究人员将K5D1及B6对照小鼠的胸腺消化之后，利用磁珠分选的方法分离到了用于转录组与蛋白质组学分析的cTECs和mTECs（样本策略），进行RNA-Seq与TMT标记的定量蛋白组学质谱分析（组学策略）。与高度相似的K5D1和B6小鼠来源的细胞基因表达谱不同，cTECs和mTECs之间基因表达谱存在显著差异(图2A-C)，主要为cTECs和mTECs功能独特性的相关基因，如mTECs中检测到的Aire-依赖性与-非依赖性的编码组织限制性自身抗原基因表达水平显著高于cTECs (图2 G)。

图2. cTECs及mTECs RNA测序分析

接下来，作者对K5D1小鼠分离的胸腺上皮细胞 (cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(mTECs)进行了TMT标记的定量蛋白组学质谱分析，总共定量到5,753个蛋白。cTECs和mTECs的蛋白组表达谱也存在明显的差异。308种蛋白质在mTECs比cTECs中表达量显著增加，其中202个蛋白对应的mRNA在mTECs表达明显增高，这些蛋白主要与mTECs发育相关。232个蛋白在mTECs表达显著降低，其中199个蛋白对应的mRNA表达量也显著降低，其中包括对cTEC功能重要性的蛋白水解蛋白 (图3B)。

图3. cTECs和mTECs的蛋白质组学和联合分析

3. β5t敲除cTECs中蛋白酶体组分发生变化

在研究中作者发现，K5D1转基因小鼠胸腺的皮层区域含有β5t+cTECs和CD4/CD8双阳性胸腺细胞，β5t是胸腺蛋白酶体的cTEC特异性成分，对CD8+T细胞的最佳生成至关重要。然而，目前还不清楚β5t促进CD8+T细胞发育的具体分子机制。研究者进一步分析了β5t-缺失小鼠cTECs的转录和蛋白质表达谱。

GO分析发现，β5t的缺失导致了cTECs中蛋白酶体组分的高度特异性改变。大部分蛋白酶体成分，包括20S核心颗粒组份，与19S调节颗粒组分表达量，在β5t敲除后明显减少，相反，β5i和β5表达量上升代偿β5t缺陷以维持蛋白酶体复合物（图4B-D）。免疫印迹实验也证实了这一结果。

图4. β5t缺陷小鼠cTECs中蛋白酶体成分发生改变

综上所述，本研究利用基因改造的胸腺增大但功能正常小鼠，对cTECs和mTECs进行蛋白组学和转录组学的联合分析，鉴定到了决定cTECs和mTECs发育及功能不同的重要特征分子。结果揭示了胸腺蛋白酶体对cTECs蛋白酶体亚单位组成高度特异性影响，为进一步探索胸腺生物学的形成提供了一个整合性跨组学分析平台。

参考文献

Izumi Ohigashi, et al., 2019, Trans-omics Impact of Thymoproteasome in Cortical Thymic Epithelial Cells. Cell Reports.

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