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作者:小丫 来源:嘉因
去年6月,小丫写了这篇帖子,吸引了好多小伙伴儿用这套方法做验证,有了困惑通过销售转告给小丫,小丫解答的很开心~ ~ ~
现在重新整理一下帖子,力求描述的更清晰,希望能更方便的帮助更多的小伙伴儿 ~
做了miRNA-seq,找到差异表达miRNA后,要做验证,Taqman探针好贵,LNA也没便宜多少~
我要做的miRNA不在商品化的探针目录里,需要定制,贵,时间还长~
有什么高效且经济的方法吗?
小丫今天推荐带接头的引物+SybrGreen染料法:
一步完成加polyA尾巴和反转录;
用miRprimer软件设计基因特异的上下游引物,用SybrGreen做qPCR。
溶解曲线漂亮,Ct值20出头,跟miRNA-seq趋势一致;
小丫的小伙伴儿亲测,人、小鼠、果蝇,都有效。
原理一目了然:
第一步:设计基因特异引物:
小丫喜欢把该物种的所有miRNA都设计出来,需要做哪个基因,把相应的引物复制出来就好。
1. 到miRBase下载该物种的所有miRNA序列:
进入http://www.mirbase.org,点击Browse;
Expand all,点击你要的物种的拉丁名;
进入这个页面:
在最下方,选择Mature sequence,点击select all,点击Fetch Sequences,就获得了该物种的所有miRNA成熟体序列。
复制,粘贴到一个文本文件中,一定要扩展名是txt的那种最简单的文本文件,文件名一定要叫input_miRs.txt。
2. 进入https://sourceforge.net/projects/mirprimer,下载miRprimer,把这7个文件都下载到同一个文件夹,给文件夹取个名字叫miRprimer。
把第一步获得的input_miRs.txt文件也放入miRprimer文件夹中。它一次最多计算25个miRNA的引物,所以,如果你的miRNA列表超过25个,需要分多次放入imput_miRs.txt文件当中。
注:文件名只能是input_miRs.txt,否则这个软件不认识~~
在Windows系统下双击miRprimer2.exe,会有个黑色窗口闪过,没错,就是闪过,然后发现多出来5个文件,就是结果。不用设置任何参数,不用输入任何命令。
所有的引物对都在result_all_primer_pairs.txt文件里,相邻的两行是一对引物,例如,F_3和R_2是第一对引物,F_2和R_2是第二对引物。
刚开始为了节约时间,小丫给每个miRNA合成了2对引物。
2对引物可能只有3条,而不是4条,因为共用了一条下游引物R_2。
检测溶解曲线是否干净,查看Ct值是否太大。保留一个溶解曲线干净,Ct值低的做样品的qPCR。
亲测20个miRNA,往往是第一对引物就很好用,溶解曲线很干净,Ct值介于20-30之间。
有个别miRNA的两对引物都有双峰,又合成了第三对引物,还是有双峰,这样的miRNA就得换实验方法了。
所以,推荐的策略是:每个miRNA先合成一对引物,如果不好用,再合成第2、3对引物,再不好用,换实验方法。
最好的一对都给整理好了,在result_best_primer_pairs.txt文件里:
拿这对引物做qPCR,文章作者的成功率也很高:
第二步:合成通用的反转录引物和基因特异引物。
反转录引物序列:5’-CAGGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTVN, where V is A, C and G and N is A, C, G and T.
引物合成订单表如下:
连同第一步获得的基因特异引物一起送公司合成,PAGE级别。
第三步:加polyA和反转录
反应体系如下:
1ul 10X polyA polymerase buffer(NEB, M0276S)
1ul 1mM ATP(20ul 10mM + 180ul H2O)
1ul 10uM RT-primer
1ul 1mM dNTP(NEB, N0447S, 20ul 10mM + 180ul H2O)
0.5ul 200U/ul SuperScript® III Reverse Transcriptase(Invitrogen, 18080093)
0.2ul 100U/200ul polyA polymerase (NEB, M0276S)
10pg to 100 ng RNA sample
complete with RNase-free water up to 10ul.
反应条件如下:
42C, 1h;95C, 5min
稀释:
4 ~ 8 X,分装,-20C冻存。
注:RNA的量一定要按照要求控制好,10ul体系10pg to 100 ng RNA sample,不要贪多。
总RNA里miRNA的比例的确很低,所幸Invitrogen的SuperScript® III Reverse Transcriptase反转录效率很高。如果RNA加的太多,反而降低反转录效率,得不偿失,切记!!
第四步,RT-qPCR
反应体系:
10ul SybrGreen Master Mix(Roche, 4913914001)
9ul primer(50ul 2uM Forward primer + 50ul 2uM Reverse primer + 900ul H2O)
1ul cDNA
反应条件:
95C, 5min;
95C, 15s; 60C, 30s; 40 cycles
95C, 15s;
60C, 30s;
4C, 1h
仪器:ABI StepOnePlus,用机器默认的溶解曲线程序。
注:原文使用的反转录酶是NEB的MuLV,亲测1/3的miRNA的Ct值超过了30,改用Invitrogen的SuperScript® III Reverse Transcriptase,所有miRNA的Ct值降至20出头。
所以推荐使用反转录效率高的SSIII,价格贵一半,效率高2的n次方。
该方法出自文献:
方法:doi:10.1186/1471-2105-15-29
软件:doi:10.1186/1472-6750-11-70
protocol:10.1007/978-1-4939-1062-5_7
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