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一、产品简介:
S-CL主要来源于土壤微生物,S-CL催化农作物秸秆产生的葡萄糖是主要的碳源营养物质。本产品采用3,5-二硝基水杨酸法测定S-CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 自备 | 4℃保存 | 甲苯 |
试剂二 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体6 mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存(即为10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵、天平、可调式移液器、30-50目筛、甲苯(>98%,AR)和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干,过30-50目筛。
【注】:土壤风干,减少土壤中水分对于实验的干扰;
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 180 | 20 | 1 |
S2 | 10 | 184 | 16 | 0.8 |
S3 | 10 | 188 | 12 | 0.6 |
S4 | 0.8 | 100 | 100 | 0.4 |
S5 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
S6 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
土样(g) | 0.05 | 0.05 | - | - |
试剂一 | 25 | 25 | - | - |
- | 煮沸15min(缠封口膜, 防止爆盖) | 振荡混匀,室温放置15min | - | - |
试剂二 | 45 | 45 | - | - |
试剂三 | 185 | 185 | - | - |
蒸馏水 | 45 | 45 | - | - |
振荡混匀,40℃水浴糖化1h 后,煮沸15min(缠封口膜,防止爆盖),冷却至室温,10000rpm,25℃离心10min,取上清得糖化液。 | - | |||
糖化液 | 15 | 15 | - | - |
标准溶液 | - | - | 15 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 15 |
试剂四 | 35 | 35 | 35 | 35 |
混匀, 沸水浴中煮沸显色15min(缠封口膜,防止爆盖),冷却至室温。 | ||||
蒸馏水 | 250 | 250 | 250 | 250 |
充分混匀,于540nm处读取吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,∆A标准=A标准-A空白。(注:每个样本需做一个自身对照,空白管和标准曲线只需做1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将上清液用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当延长反应时间(T)后再进行测定,并将改变后的T和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、S-CL活力计算:
单位定义:每天每 g 土样中产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活性单位(U)。
S-CL 酶活(U/g 土样)=x×V ÷W÷T×D =144×x×D
T:反应时间,1h=1/24d; V :反应体系总体积,0.3mL;
D:稀释倍数,未稀释即为1; W:样本质量,0.05g。
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