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一、产品简介:
蔗糖酶即蔗糖转化酶(Invertase,E.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适PH值,蔗糖转化酶分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型,许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。 AI的最适pH为3.0~5.0,AI分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI(B-AI)两种类型。前者分布在液泡中或细胞自由空间,后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。B-AI 主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维持库源之间蔗糖的浓度。
B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,经光谱扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液A | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
提取液 B | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加入 10mL 试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存。 |
试剂三 | 液体15mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:
①称取约0.1g组织,加入1mL提取液A,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min,弃上清,留沉淀。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②沉淀中加入 1mL 蒸馏水,震荡混匀,12000rpm,4℃离心 10min,弃上清,留沉淀。
③沉淀中加入 1mL 提取液 B充分混匀,4℃浸提过夜,12000 rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成1.5、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 850 | 150 | 1.5 |
S2 | 1.5 | 300 | 600 | 1.0 |
S3 | 1.0 | 500 | 500 | 0.5 |
S4 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
S5 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm。
② 操作表:
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |||
样本 | 50 | 50 | - | - | ||
标准液 | - | - | 50 | - | ||
蒸馏水 | - | - | - | 50 | ||
试剂一 | - | 200 | 200 | 200 | ||
试剂二 | 200 | - | - | - | ||
混匀,37℃准确水浴30min后,95℃水浴10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)。 | - | |||||
试剂三 | 125 | 125 | 125 | 125 | ||
混匀,95℃水浴10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,吸取200μL反应液转移至96孔板中,测定540nm处吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次,每个测定管需设一个对照管)。 |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按蛋白浓度计算:
单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位(U)。
B-AI活性(U/mg prot)=x×V1×103÷(V1×Cpr)÷T=33.3×x÷Cpr
3、按样本质量计算:
单位定义:37℃每克组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位(U)。
B-AI活性(U/g 质量)=x×V1×103÷(W×V1÷V)÷T=33.3×x÷W
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;
T:反应时间,30min; W:样本质量,g;
Cp:样本蛋白质浓度,mg/mL。
注意事项:
1、如果加入试剂三,煮沸 10min 后有混浊物出现,建议离心除去沉淀后,取上清测定吸光度;
2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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