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一、产品简介:
原花青素(Oligomeric Proantho Cyanidins,OPC)是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚化合物,广泛存在于植物的各种器官中,具有极强的抗氧化性和清除自由基的作用,广泛的应用于医药,食品,化妆品,保健品行业。
在酸性条件下,植物原花青素A环上的间苯二酚和间苯三酚与香草醛发生缩合反应,产生有色化合物,在500nm处有特征吸收峰,测定500nm光吸收值可计算原花青素的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体70mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 | 临用前加入5mL甲醇,充分溶解,配制好的试剂三应尽快使用,2-8℃保存时间不超过一个月。 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL提取液,充分溶解。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、甲醇和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行匀浆,用超声法进行提取(功率300W,温度25℃,时间30min),12000rpm,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用提取液稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 900 | 100 | 1 |
S2 | 1 | 40 | 160 | 0.8 |
S3 | 1 | 80 | 120 | 0.6 |
S4 | 0.8 | 100 | 100 | 0.4 |
S5 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
S6 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至500nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 40 | 40 | - | - |
标准液 | - | - | - | 40 |
试剂一 | - | 160 | 40 | - |
试剂二 | 80 | - | 80 | 80 |
试剂三 | 80 | - | 80 | 80 |
混匀后,30℃,准确反应30min,测定500nm处的吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,∆A标准=A标准-A空白。(注:每个样本做一个自身对照,空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按照样本质量计算:
原花青素含量(mg/g 质量)=x×V÷W×D=x÷W×D
3、按照蛋白浓度计算:
原花青素含量(mg/mg prot)=x×V÷(Cpr×V)×D=x÷Cpr×D
V:加入提取液体积,1mL; W:样品质量,g;
D:稀释倍数,未稀释即为1; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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