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一、产品简介:
花色苷是一类易溶于极性溶剂的天然色素,属黄酮类化合物。花色苷广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中,使其呈现由红到紫等不同颜色,是植物主要的呈色物质。
根据花色苷在不同pH下的结构性质测定花色苷含量,在pH为1时花色苷在530nm处有最大吸收峰,而当pH为4.5时,花色苷转变为无色查尔酮形式在530nm处无吸收峰,通过测定不同pH下的530nm和700nm处的吸光度值计算样本中花色苷的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液,75℃震荡提取25min,若提取过程中提取液有损失,最后可用提取液定容至1mL后,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。
【注】:a、若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取;b、若是固体干样本,先磨碎并过40目筛后,取0.02g的过筛后干样,加入1 mL提取液,其他步骤同上。最后离心得到的上清液待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至530nm和700nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 |
上清液 | 20 | 20 |
试剂一 | 180 | - |
试剂二 | - | 180 |
混匀后,室温(25℃),避光静置60min,测定530nm和700nm处的吸光值A,测定管在 530nm 和 700nm 处的吸光值记为 A1、A2,对照管在 530nm 和 700nm 处的吸光值记为 A3、A4,计算 ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)。 |
4、正式实验:
① 如果A1大于1,可以适当加大稀释倍数,保证总体积200μL不变,如10μL上清液和190μL试剂一(相当于稀释20倍);如果A1小于0.1,可以适当缩小稀释倍数,保证总体积不变,如100μL上清液和100μL试剂一(相当于稀释2倍),使A1保持在0.1~1范围内,可提高检测灵敏度;注意应同样调整上清液和试剂二体积比例;计算时以实际加样体积代入计算公式中;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:
1、按照样本质量计算:
总花色苷含量(μg/g)=(ΔA÷(ε×d)×V×Mr×106)×D÷W=16.7×ΔA×D÷W
2、按照样本蛋白浓度计算:
总花色苷含量(μg//mg prot)=(ΔA÷(ε×d)×V×Mr×106)×D÷(Cpr×V)=16.7×ΔA×D÷Cpr
ε:为矢车菊-3-葡萄糖苷消光系数,26900L/mol/cm;
Mr:为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量,449.2g/mol;
d:比色皿光径,1cm; D:稀释倍数,该反应体系下为10;
V:样本提取液,1mL=0.001L; W:样本质量,g。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按照样本质量计算:
总花色苷含量(μg/g)=(ΔA÷(ε×d)×V×Mr×106)×D÷W=33.4×ΔA×D÷W
2、按照样本蛋白浓度计算:
总花色苷含量(μg//mg prot)=(ΔA÷(ε×d)×V×Mr×106)×D÷(Cpr×V)=33.4×ΔA×D÷Cpr
ε:为矢车菊-3-葡萄糖苷消光系数,26900L/mol/cm;
Mr:为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量,449.2g/mol;
d:96孔板光径,0.5cm; D:稀释倍数,该反应体系下为10;
V:样本提取液,1mL=0.001L; W:样本质量,g。
注意事项:
因提取液会使蛋白变性,若使用蛋白浓度计算需用PBS单独提取后自行测定。
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