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一、产品简介:
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶,是一类广泛分布于动物、植物、微生物和培养细胞中的含铜质体金属酶,能够催化多酚类物质氧化为醌,进而引起植物叶片、果实等发生褐变,其活性对于果蔬加工、保藏及茶叶初加工等过程具有重要作用。
多酚氧化酶能够催化邻苯二酚生成醌,产物在410nm处具有特征吸收峰,通过吸光值变化即可表征多酚氧化酶的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体5mL×1瓶 | 4℃避光保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至410nm。
② 对照管样本的制备:取适量样本上清液95℃处理5min(密封以防止水分散失),冷却至室温。
③ 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 50 | 50 |
样本 | 50 | - |
煮沸的样本 | - | 50 |
①37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应10min; ②立即95℃处理10min(密封以防止水分散失); ③冷却至室温后,10000rpm,25℃离心10min,取上清; ④吸取200μL上清液至96孔板中,测定410nm处的吸光值,记为A测定和A对照,计算ΔA=A测定-A对照。(注:每个样品均需设一个对照管。) |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
单位定义:每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
2、按组织样本质量计算:
单位定义:每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/g质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷W
3、按照液体体积计算:
单位定义:每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T=60×ΔA
4、按细菌或细胞数量计算:
单位定义:每分钟每104个细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/104 cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷N
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.05mL;
V2:反应体系总体积,0.3mL; T:反应时间,10min;
W:样品质量,g; N: 细胞数量,以万计;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
单位定义:每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr
3、按组织样本质量计算:
单位定义:每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/g质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷W
3、按照液体体积计算:
单位定义:每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T=120×ΔA
4、按细菌或细胞数量计算:
单位定义:每分钟每104个细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。
PPO活性(U/104 cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷N
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.05mL;
V2:反应体系总体积,0.3mL; T:反应时间,10min;
W:样品质量,g; N: 细胞数量,以万计;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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