一、产品简介：

过氧化氢酶（Catalase，CAT）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物演化过程中建立起来的生物防御系统关键酶，其主要功能是催化生物体内的H₂O₂分解，使机体免受自由基损伤，在活性氧清除系统中具有重要作用。

H₂O₂在240nm处具有特征吸收峰，过氧化氢酶能够分解H₂O₂，使反应溶液在240nm处吸光值随反应时间而下降，根据吸光值变化速率即可表征过氧化氢酶的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板（UV板）、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；建议500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清置于冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至240nm。

② 试验前将工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10min。

③ 操作表：

3、正式实验：

① 反应过程气泡过多表明酶活性过高，结果可能为负值，建议将提取后样本上清使用提取液适当稀释后再进行测定；若稀释样本或反应体系没有产生气泡仍然出现较小的负值，说明该样本测不到CAT活性；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本质量计算：

活性单位定义：每g组织每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT(U/g质量)=[ΔA×V÷(ε×d)×10⁶]÷(V1×W)×D÷T=458.7×ΔA÷W×D

2、按样本蛋白浓度计算：

活性单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT(U/mg prot)= [ΔA×V÷(ε×d)×10⁶]÷(V1×Cpr)×D÷T=458.7×ΔA÷Cpr×D

3、按细胞数量计算：

活性单位定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT酶活(U/10⁴ cell)= [ΔA×V÷(ε×d)× 10⁶]÷(N×V1÷V2)×D÷T=458.7×ΔA÷N×D

4、按照液体体积计算：

活性单位定义：每mL液体在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂定义为一个酶活力单位（U）。

CAT(U/mL)=[ΔA×V÷(ε×d)×10 ⁶]÷V1×D÷T=458.7×ΔA×D

V：反应体系总体积，2×10^-4L；           ε：H₂O₂摩尔吸光系数，43.6L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；                  V1：加入样本体积，0.01mL；

V2：加入提取液体积，1mL；             T：反应时间，1min；

W：样本质量，g；                      N：细胞数量，以万计；

10⁶：单位换算系数，1mol=10 ⁶μmol；      Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本质量计算：

活性单位定义：每g组织每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT(U/g质量)=[ΔA×V÷(ε×d)×10⁶]÷(V1×W)×D÷T=917.4×ΔA÷W×D

3、按样本蛋白浓度计算：

活性单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT(U/mg prot)= [ΔA×V÷(ε×d)×10⁶]÷(V1×Cpr)×D÷T=917.4×ΔA÷Cpr×D

3、按细胞数量计算：

活性单位定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位(U)。

CAT酶活(U/10⁴ cell)= [ΔA×V÷(ε×d)× 10⁶]÷(N×V1÷V2)×D÷T=917.4×ΔA÷N×D

4、按照液体体积计算：

活性单位定义：每mL液体在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂定义为一个酶活力单位（U）。

CAT(U/mL)=[ΔA×V÷(ε×d)×10 ⁶]÷V1×D÷T=917.4×ΔA×D

V：反应体系总体积，2×10^-4L；           ε：H₂O₂摩尔吸光系数，43.6L/mol/cm；

d：96 孔板光径，0.5cm；                V1：加入样本体积，0.01mL；

V2：加入提取液体积，1mL；             T：反应时间，1min；

W：样本质量，g；                      N：细胞数量，以万计；

10⁶：单位换算系数，1mol=10 ⁶μmol；      Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

1、若吸光值超过 3，请检查使用的是否为石英比色皿或 UV 板；

2、使用96孔UV板测定时建议使用多道移液器，且分次进行检测，以确保组间反应时间一致。