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一、产品简介:
过氧化氢酶(Catalase,CAT)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是生物演化过程中建立起来的生物防御系统关键酶,其主要功能是催化生物体内的H2O2分解,使机体免受自由基损伤,在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2在240nm处具有特征吸收峰,过氧化氢酶能够分解H2O2,使反应溶液在240nm处吸光值随反应时间而下降,根据吸光值变化速率即可表征过氧化氢酶的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体2mL×1支 | 4℃避光保存 | |
工作液 | 空瓶×1支 | 4℃保存 | |
工作液的配制(现用现配):使用前吸取1.5mL试剂二加入28.5mL试剂一(或按比例配制)充分混匀,配制后4℃可保存一周。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置于冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至240nm。
② 试验前将工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)预热10min。
③ 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 10 |
工作液 | 190 |
迅速混匀并开始计时,立即测定240nm处5s时吸光值A1和65s时吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。 |
3、正式实验:
① 反应过程气泡过多表明酶活性过高,结果可能为负值,建议将提取后样本上清使用提取液适当稀释后再进行测定;若稀释样本或反应体系没有产生气泡仍然出现较小的负值,说明该样本测不到CAT活性;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本质量计算:
活性单位定义:每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/g质量)=[ΔA×V÷(ε×d)×106]÷(V1×W)×D÷T=458.7×ΔA÷W×D
2、按样本蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/mg prot)= [ΔA×V÷(ε×d)×106]÷(V1×Cpr)×D÷T=458.7×ΔA÷Cpr×D
3、按细胞数量计算:
活性单位定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT酶活(U/104 cell)= [ΔA×V÷(ε×d)× 106]÷(N×V1÷V2)×D÷T=458.7×ΔA÷N×D
4、按照液体体积计算:
活性单位定义:每mL液体在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/mL)=[ΔA×V÷(ε×d)×10 6]÷V1×D÷T=458.7×ΔA×D
V:反应体系总体积,2×10-4L; ε:H2O2摩尔吸光系数,43.6L/mol/cm;
d:比色皿光径,1cm; V1:加入样本体积,0.01mL;
V2:加入提取液体积,1mL; T:反应时间,1min;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
106:单位换算系数,1mol=10 6μmol; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按样本质量计算:
活性单位定义:每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/g质量)=[ΔA×V÷(ε×d)×106]÷(V1×W)×D÷T=917.4×ΔA÷W×D
3、按样本蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/mg prot)= [ΔA×V÷(ε×d)×106]÷(V1×Cpr)×D÷T=917.4×ΔA÷Cpr×D
3、按细胞数量计算:
活性单位定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位(U)。
CAT酶活(U/104 cell)= [ΔA×V÷(ε×d)× 106]÷(N×V1÷V2)×D÷T=917.4×ΔA÷N×D
4、按照液体体积计算:
活性单位定义:每mL液体在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2定义为一个酶活力单位(U)。
CAT(U/mL)=[ΔA×V÷(ε×d)×10 6]÷V1×D÷T=917.4×ΔA×D
V:反应体系总体积,2×10-4L; ε:H2O2摩尔吸光系数,43.6L/mol/cm;
d:96 孔板光径,0.5cm; V1:加入样本体积,0.01mL;
V2:加入提取液体积,1mL; T:反应时间,1min;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
106:单位换算系数,1mol=10 6μmol; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
注意事项:
1、若吸光值超过 3,请检查使用的是否为石英比色皿或 UV 板;
2、使用96孔UV板测定时建议使用多道移液器,且分次进行检测,以确保组间反应时间一致。
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