2021年4月，浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，在《Stem Cell Research 》杂志上发表题为《Generation of an ELTD1 knockout human embryonic stem cell line by the iCRISPR/Cas9 system 》的文章，报道了ELTD1基因敲除人胚胎干细胞系的构建过程。文中所用细胞系的遗传质量STR鉴定，由上海翼和应用生物技术有限公司完成，对细胞系身份来源进行鉴定，在全基因组水平上与亲本细胞系H1进行比较，确认其身份，从而保证实验结果正确。
摘要
人ELTD1 (表皮生长因子，亲红蛋白和七跨膜结构域)是一种罕见的g蛋白偶联受体(GPCR)，属于粘附GPCR家族，是一种新的血管生成调控因子和潜在的抗癌靶点。然而，人们对ELTD1的功能知之甚少，其配体也没有报道。本实验通过iCRISPR/Cas9系统构建了ELTD1纯合子敲除人胚胎干细胞系FAHZUe001-A，以加深对ELTD1基因功能的理解。经体外实验证实，FAHZUe001-A具有正常核型、典型的未分化形态、多能性和三世代分化潜能。
资源表
资源效用
利用iCRISPR/Cas9系统构建了ELTD1纯合子敲除细胞系，该系统为深入研究ELTD1基因在体外胚胎发育和谱系分化中的作用提供了指示和支持信号(见表1)。
资源详细信息
ELTD1是2001年发现的孤儿基因，其隶属于GPCR超家族，现已被确定为肿瘤血管生成的新参与者(Masiero et al.，2013)。虽然ELTD1在病理和生理调节机制中起着重要作用，但是其功能机制，特别是其配体功能机制，目前尚不清楚。本研究利用iCRISPR/ Cas9系统构建了ELTD1纯合子敲除人胚胎干细胞(hESC)系，应用于未来研究。在成熟的iCRISPR/Cas9 hESC细胞系中，四环霉素可以诱导Cas9高表达。同时，sgRNAs很容易转移到iCRISPR/Cas9 hesc中，与Cas9蛋白协作获得更高的基因编辑效率。琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定同源序列插入，Western blot检测Cas9蛋白水平(补充图1A)。针对ELTD1外显子2的特异性sgRNAs在网站(http://crispor.tefor.net/crispor.py)上设计(图1A)，通过T7E1实验估算编辑效率(补充图1B)。最终，筛选得到了两种突变率高的sgRNA应用于后续实验。sgRNAs转染和单细胞筛选后，用qPCR检测cDNA突变，qPCR产物在2%琼脂糖上进行电泳检测，并通过测序分析进一步确认基因组突变(图1C和补充图1C)。最终，本研究获得了双等位基因缺失细胞系，命名为FAHZUe001-A (https://hpscreg.eu/cell-line/FA HZUe001-A)。
FAHZUe001-A具有典型的人胚胎干细胞形态(图1B，比例尺= 100 μm)和正常核型(图1G)。为研究FAHZUe001-A的多能性，本研究进行了免疫荧光和RT-qPCR实验，检测了OCT4、SOX2、NANOG等经典标记。结果表明，这些基因在细胞系中高表达(图1E和1F，比例尺= 50 μm)。此外，FAHZUe001-A细胞系保持了3种胚芽分化潜能和高表达的相关标记，包括SOX1和PAX6(外胚层)，MIXL1和T(中胚层)，FOXA2和SOX17 (endoderm)(图1D)。同时进行了短串联重复序列(STR)分析，在全基因组水平上与亲本细胞系H1进行比较，确认其身份。FAHZUe001-A无支原体污染，前3个预测脱靶位点未发生突变(补充图1D和补充图1E)。
本文所用细胞系的遗传质量STR鉴定由上海翼和应用生物技术有限公司完成。
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