资料来源：生信路，2024-03-03 19:00上海；作者：小途

片仔癀是我们国家很出名的中医药。今天这位主角出现在29分+SCI上！没错！传统中药也能发超高分SCI!今天小塔给大家带来一篇有关于片仔癀药效的研究！

首先总结一下这篇SCI到底为什么能发那么高分！

第一点，这篇SCI选题非常具有优势！早在2020年，国家就提出促进中药传承创新发展的建议。因此近几年关于中医药的研究也越来越多！并且国家提倡对来源于古代经典名方的中药可进行相关研究。而这篇SCI对知名中药片仔癀进行深入研究，正好也是非常对应这个风口！所以这也提示各位医学生！赶紧把握机会！

第二点，中医药与肠道微生物的巧妙结合！中药是一个非常复杂的系统，当中药汤剂进入人体后，会进行非常复杂的代谢过程，并多靶点地作用于人体。因此中药疗效非常难解读！而这篇文章通过构建“中药物质—药代—药效”这一体系最终阐明了肠道微生物和PZH代谢物之间的潜在相互作用。“物质—药代—药效”这一思路体系正是中医药与肠道微生物的巧妙结合的体现。这一思路能很好将中药化学物质组分及其生物效应表达的复杂关联关系体现出来。

第三点，这篇文章是以临床需求为导向研究中药。毕竟科研必须紧紧围绕临床，才能阐明中药疗效的价值。

其实研究中药如何整体调节人体状态这是近几年非常火热的研究！对于中药的研究，转录组学、代谢药代动力学、药效动力学、网络药理学等新技术都非常适合用于研究中药。对古方进行系统的二次开发研究或者以临床实践为导向，阐明其药效物质基础和作用机制，并挖掘出其核心疗效价值，这都是中医药研究的热门方向。对于这个思路，小伙伴们有没有兴趣应用在自己的研究中呢？

题目：传统药物片仔癀通过恢复肠道微生物群和代谢产物抑制结直肠肿瘤的发生

杂志：Gastroenterology

影响因子：IF=29.4

发表时间：2023年12月

研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第四大诊断癌症，也是第三大致命癌症。除了遗传因素外，肠道菌群失调有助于CRC的发生和进展。中药是治疗各种疾病的有前途的药物。然而，大多数中药的生物学原理仍有待确定。新出现的证据表明，中药可以调节肠道微生物群和代谢物，作为其有益功能的基础。然而，肠道菌群可以代谢中药的成分，这可能会影响药物疗效。因此，了解中药与肠道菌群之间的双向串扰对于为中药在疾病预防和治疗中的药理特性提供新的见解至关重要。

数据来源

研究思路

通过氧化偶氮甲烷加葡聚糖硫酸钠治疗或PZH（270 mg/kg和540 mg/kg）处理Apcmin/+小鼠建立CRC小鼠模型。通过肠通透性测定和透射电镜检测肠屏障功能。分别采用宏基因组测序和液相色谱-质谱分析粪便菌群和代谢物。无菌小鼠或接受抗生素治疗的小鼠被用作微生物群耗竭的模型。PZH以剂量依赖性方式抑制氧化偶氮甲烷+葡聚糖硫酸钠处理的小鼠和Apcmin/+小鼠的结直肠肿瘤发生。PZH处理改变了肠道菌群，益生菌Pseudobutyrivibrio xylanivorans和Eubacterium limosum的丰度增加，而致病菌Aeromonas veronii， Campylobacter jejuni， Collinsella aerofaciens和Peptoniphilus harei的丰度减少。此外，PZH增加有益代谢物牛磺酸和次牛磺酸、胆汁酸和不饱和脂肪酸，显著恢复肠屏障功能。转录组分析表明，PZH抑制PI3K-Akt、白细胞介素-17、肿瘤坏死因子和细胞因子-趋化因子信号传导。值得注意的是，PZH的化学预防作用涉及微生物群依赖和非依赖的机制。从PZH处理的小鼠移植到无菌小鼠的粪便菌群部分再现了PZH的化学预防作用。PZH的成分人参皂苷f2和人参皂苷re对结直肠癌细胞和初级类器官有抑制作用，并且PZH还抑制氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠处理的无菌小鼠的肿瘤发生。

主要结果

1.片仔癀抑制氧化偶氮甲烷加葡聚糖硫酸钠处理的小鼠和Apcmin/+小鼠的结直肠癌

为了探索PZH在结直肠肿瘤发生中的化学预防作用，作者以每天270 mg/kg（低）或540 mg/kg（高）的剂量给AOM/ DSS处理的C57BL6小鼠灌胃PZH（图1A）。PZH剂量依赖性地抑制了CRC发生率（图1B），对照组、小剂量PZH组和大剂量PZH组的肿瘤发生率分别为100%、66.67%和37.5%（图1C）。高剂量PZH治疗也显著抑制肿瘤数量（P <.05）和大小（P <.001）（图1C）。与此同时，大剂量PZH治疗显著降低了结肠癌的发生率（P <.001）和抑制细胞增殖（P <.001），分别通过he染色和Ki-67染色进行评估（图1D）。接下来，在Apcmin/+小鼠中验证了PZH的化学预防作用（图1E和补充图1）。一致地，高剂量PZH治疗显著降低了结肠肿瘤数量和大小 （图1F和G）。此外，高剂量PZH降低了结肠癌的发生率和增殖细胞百分比（图1H）。 

图1 在AOM/DSS处理的小鼠和Apc^min/+小鼠中，PZH均能剂量依赖性地抑制结直肠肿瘤的发生

2.片仔癀逆转结直肠癌的肠道生态失调

为了确定PZH是否在结直肠癌发生过程中调节肠道菌群，作者对两个结直肠癌模型的粪便样本进行了鸟枪法宏基因组测序分析。值得注意的是，PZH处理显著增加了α多样性，通过主坐标分析β多样性显示PZH对肠道菌群有重塑作用（图2A和B）。在两种模型中，PZH均富集了益生菌Eubacterium limosum和Pseudobutyrivibrio xylanivorans。接下来，从PZH和对照组之间鉴定出的差异细菌构建了生态网络（图2D）。在PZH处理的小鼠中，益生菌和致病菌之间发现了共排除相关性，这意味着PZH富集的益生菌可能会拮抗CRC致病菌。综上所述，这些数据表明PZH可能逆转CRC中的微生物生态失调。

进一步研究了富含PZH的益生菌，木栖菌和E limosum在结直肠癌中的功能。研究发现，木杆菌或E limosum的培养上清液显著抑制CRC细胞（DLD1和HT-29）的活力和集落形成，而对正常结肠上皮细胞（NCM460）无影响（图2F和G），这表明PZH富集的细菌可能至少部分有助于预防CRC。为了确定肠道微生物群和代谢产物是否支持PZH在CRC中的化学预防作用，将PZH治疗（PZH-粪菌移植[FMT]）或溶剂治疗（control-FMT）常规小鼠的粪便样本灌胃给AOM/DSS治疗的受者无菌小鼠（图2H）。PZH-FMT显著减少结肠肿瘤数量和负荷、与control-FMT在AOM/ dss处理的无菌小鼠中的比较（图2H）。这些数据表明，PZH的抗癌作用至少部分依赖于微生物群。

图2 PZH治疗可逆转微生物生态失调

3.片仔癀调节结直肠癌中的肠道代谢物

鉴于肠道菌群分泌的代谢物在调节健康和疾病中发挥着重要作用，作者接下来在AOM/DSS模型和Apcmin/+模型中对高剂量PZH处理的小鼠和对照组小鼠的粪便样本进行了代谢谱分析。主成分分析和偏最小二乘判别监督分析均显示，在两个CRC模型中，代谢组与PZH和对照组明显分离（图3A）。在AOM/DSS模型中，35种代谢物在PZH治疗组小鼠的粪便中与对照组小鼠相比有显著改变（图3B）。在这些代谢物中，有7种是通过液相色谱-串联质谱法对PZH成分进行并排比较而获得的（图3B）。通路富集分析显示，PZH上调牛磺酸和次牛磺酸代谢、初级胆汁酸生物合成和不饱和脂肪酸生物合成（图3C）。为了将这些代谢物与肠道微生物的潜在代谢活动关联起来，作者对改变的细菌和代谢物进行了整合分析。观察到益生菌L gallinarum与TCA呈正相关（图3D），P xylanivorans和E limosum与16-羟基十六烷酸和戊二酸呈正相关（图3D）。此外，P xylanivorans、E limosum、L gallinarum和L acidophilus与ricinoleacid和SDA呈正相关（图3E）。然而，致病菌P harei、C aerofaciens、A veronii和C aerofaciens与蓖麻油酸、SDA和16-羟基十六烷酸呈负相关（图3D和E）。    

图3 PZH改变粪便中肠道菌群相关代谢物

4.片仔癀恢复结直肠癌的肠屏障功能

肠道菌群失调是肠屏障功能障碍的重要因素。为了评估PZH是否会影响肠屏障功能，在AOM/DSS和Apcmin/+小鼠模型中进行了异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（dextran）肠道通透性测定。如图4A所示，高剂量PZH显著降低AOM/ DSS处理的小鼠和Apcmin/+小鼠的血清FITC-dextran水平。还检测了血清细菌脂多糖，肠屏障完整性的另一个标志物，在高剂量PZH组中持续降低（图4A）。与此同时，PZH通过透射电子显微镜恢复了肠道屏障结构（图4B）。通过免疫组织化学染色，pzh处理的小鼠紧密连接蛋白，包括E-cadherin（一种细胞黏附分子）和ZO-1（紧密连接的关键成分，作为肠屏障完整性的标志）的表达均升高（图4 c）。Western blot和定量聚合酶链反应显示，PZH显著增加e-钙黏蛋白（CDH1）、Occludin （OCCLN）和ZO-1的表达（图4D和E）。这些发现表明pzh -肠道菌群轴可能有助于肠道屏障功能的恢复。

图4 PZH可恢复CRC诱导的肠屏障功能障碍

5.片仔癀抑制结直肠癌的致癌和促炎信号传导

为了从分子水平了解PZH在结直肠癌中的肿瘤抑制作用，对两个结直肠癌模型的结肠组织进行了RNA测序。与对照组相比，PZH处理的小鼠中有588个基因表达上调，373个基因表达下调。京都基因和基因组百科全书富集分析鉴定出PI3K-Akt信号通路是PZH处理后下调最明显的通路（图5A1和A2）。为支持这一观点，PZH治疗抑制了两种CRC模型结肠组织中的p-Akt表达（图5B）。因此，PZH抑制了CRC中致癌的PI3K-Akt信号通路。肠道菌群失调与结直肠癌炎症密切相关。PZH可以抑制促炎白细胞介素（IL）-17信号传导、肿瘤坏死因子（TNF）信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路（图5C）。通过小鼠炎症反应和自身免疫聚合酶链反应阵列，在AOM/DSS模型中，PZH处理后编码细胞因子及其受体的21个基因均减少（图5D），定量聚合酶链反应证实了这一点，PZH处理降低了结肠组织中的Ccl2、Cxcl2、Cxcl5、TNF-α和Il17α信使RNA（图5E）。此外，通过酶联免疫吸附试验验证了小鼠血清中Cxcl5和TNF-α水平的降低（图5F）。总之，这些数据表明，PZH对CRC的作用是由致癌和免疫相关的信号级联介导的。    

图5 PZH抑制结肠上皮中致癌性PI3K-Akt通路和促炎通路的表达 

6.片仔癀的化学预防作用涉及微生物群依赖性和非依赖性成分

接下来，在无菌小鼠中评估了AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生（图6A）。与常规无菌小鼠相比，无菌小鼠的结直肠肿瘤发生减少。此外，在无菌小鼠中，PZH比常规处理的小鼠具有更强的化学预防效果（图6B和C）。这表明，PZH对CRC的作用可能涉及PZH代谢物对结肠组织的直接作用。为了验证这一点，在使用或不使用PZH的无菌小鼠中进行了代谢组和转录组研究。代谢组的PCA和偏最小二乘判别分析表明，PZH组和对照组从AOM/ DSS处理的无菌小鼠中明显分离（图6D）。结果发现，在PZH处理的无菌模型和传统AOM/DSS模型中，16-羟基十六烯酸、CA、TCA和青光眼素的富集一致（图3B和6E）。与对照小鼠相比，这些成分在PZH处理的常规小鼠（图3B和C）和无菌小鼠（图6E）中也持续显著富集。RNA测序证实，在PZH处理的无菌小鼠中，炎症信号通路下调，包括IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路和趋化因子信号通路（图6F），这与传统AOM/DSS模型中的情况相似（图5C），这意味着PZH成分可以抑制CRC中的炎症。与此同时，PZH恢复了AOM/ DSS处理的无菌小鼠的肠屏障功能，表现为血清FITC-葡聚糖和脂多糖的下调，以及紧密连接蛋白（包括E-cadherin、Occludin和ZO-1）的表达下调（图6G）。为了阐明肠道微生物群对PZH恢复肠道屏障功能的贡献，我们将PZH处理的常规小鼠的粪便分离成细菌（PZH-bac）和代谢物（PZH-met）组分，然后移植到AOM/dss处理的小鼠中（图6H）。PZH-bac和PZH-met都部分恢复了肠道屏障功能，并抑制了结直肠肿瘤的发生（图6I，J，K和L），这意味着PZH相关的微生物群和代谢产物（包括PZH含量）都有助于PZH对肠道屏障完整性的有益作用。

图6 PZH的化学预防作用涉及微生物群依赖性和非依赖性成分

7.片仔癀抗癌人参皂甙对结直肠癌具有直接化学预防作用

接下来研究了PZH的活性成分。使用或不使用抗生素混合物的PZH处理小鼠的粪便样本在熟肉培养基中培养，随后在有氧或厌氧条件下在含有PZH的脑心灌注培养基中培养。然后通过非靶向超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析这些样品中的PZH成分（图7A）。特别地，观察到多种人参皂苷被需氧微生物下调。这说明人参皂甙可能是PZH的活性成分（图7B）。接下来的问题是人参皂苷是否是介导PZH化学预防作用的成分。观察到G-Re和G-F2抑制DLD1和HT-29细胞的增殖（图7C），而对NCM460细胞无影响。G-Re和G-F2抑制DLD1和HT-29细胞的集落形成（图7D），并且直接抑制CRC细胞中的致癌和促炎信号传导（图7E）。此外，我们使用或不使用G-Re和G-F2治疗患者来源的CRC类器官，表明G-Re和G-F2显著抑制CRC类器官的生长（图7F）。综上所述，这些结果表明PZH的成分G-Re和G-F2可以直接在结直肠癌中发挥肿瘤抑制作用。

图7 PZH抗癌人参皂甙对结直肠癌具有直接的化学预防作用

小  结

本文采用了一种系统的方法来研究片仔癀-肠道微生物群串扰在预防CRC中的作用，使用自发性CRC和无菌小鼠模型，并证明片仔癀抑制结直肠癌的发生；并且还使用无菌或抗生素处理的小鼠中检测了片仔癀对结直肠癌的化学预防作用；从而阐明了肠道微生物与片仔癀代谢物之间的潜在相互作用，从而调节片仔癀在结直肠癌中的疗效。这篇文章成功拿下高分SCI的模式：热点话题结合“中药物质-药代-药效”思路体系，科研价值满满！小伙伴们可以找找自己研究课题的疾病特点，辅助以小途提供的生信思路，如果技术上无法实现，也能找小途复现的哟！