亮点
衰老过程中70%的基因表达变化是对微生物组的反应
一些最常见的衰老特征从未发生在无菌的苍蝇身上
应激反应、免疫力和大多数代谢变化都依赖于微生物群
不依赖微生物的衰老特征可以作为年龄的生物标志物
摘要
随着年龄的增长，生命力的内在下降和外部伤害的积累都会限制寿命。对于衰老的缺陷，存在着一种普遍的看法，它反映在与年龄有关的基因表达变化模式上，这种模式在不同的物种中是保守的。然而，在这里，通过比较常规饲养或无菌饲养的果蝇的基因表达谱，我们显示这些保守的、与年龄相关的基因表达变化中，有70%以上没有发生在无菌苍蝇身上。在无菌条件下未能显示时间依赖性变化的过程中，有两个老化特征是在整个系统发育中观察到的，即压力反应基因的表达下降和先天免疫基因的表达增加。这些包括生物体用来应对细菌的适应性策略，而不是年龄依赖性衰退的不可避免的组成部分。其他过程的变化是独立于微生物组的，可以作为个体衰老的自主标志。
图1. 微生物组的缺失会影响寿命和衰老
（A）以传统方式（黑色曲线）或无菌（红色曲线）饲养的交配雄性苍蝇的存活百分比与日龄的关系图。绘制的数值是平均值±SEM；使用Logrank（Mantel-Cox）测试计算的P值；括号内是苍蝇的起始数量。数据来自两个生物重复，分别由3或4个技术重复组成。
(B) 两种条件下的寿命中位数为平均值±SD。灰色和红色分别表示单个技术重复的中位生存期。紫色圆圈和正方形代表传统苍蝇的两个生物重复的平均值；蓝色圆圈和正方形代表无菌苍蝇的两个生物重复的平均值。通过Mann-Whitney 检验显著性。
(C) 产生基因表达年龄指标的实验设计。
(D) 利用常规饲养的苍蝇的基因表达谱数据建立了转录组年龄（计算年龄）的线性模型，并用于计算无菌苍蝇的有效年龄（详见STAR方法；所有条件的5次生物重复）。常规样品：重复样品为灰色圆圈；平均值为紫色圆圈；标明SD。无菌样本，重复样品为红色圆圈；平均值为蓝色方块；标明SD。黑线是常规饲养样品的计算年龄与时间年龄的回归线；红色虚线是轴流样品的回归线。
(E）数据总体结构的主成分分析（PCA）图。基于所有基因的PCA是相对于第一和第二主成分（上图）或第三和第四主成分（下图）而绘制的。绿色、黄色、橙色和红色的圆圈代表常规样本，黄色、橙色和红色的方块表示指定年龄的无菌样本。
图2. 抗生素以及常规和无菌条件下年龄相关变异影响的量化
(A）从五个生物过程（新陈代谢、嗅觉、角质层、应激反应和免疫，如图所示）中选择八个代表性基因进行qPCR验证。在用Rpl32归一化后，与10天的无菌样品相比，计算出倍数变化。条形图代表平均值±SEM；每个条形图的底部显示了重复数。Conventional： 在常规食物中饲养10天的苍蝇； Axenic： 苍蝇在有抗生素补充的食物中饲养10天； Axenic-Ab：将5天大的无菌苍蝇转移到没有抗生素的无菌食物中，再饲养5天; Reinfection： 5天大的无菌苍蝇转移到以前用于生长常规苍蝇的小瓶中，再养5天。
(B)如图所示，计算基因表达的年龄相关方差的不同方法分别应用于常规饲养的苍蝇和无菌苍蝇的数据并进行比较。
图3. 年龄相关基因的相对表达热图
在常规条件下，根据多序列相关选择为年龄相关的所有基因的相对表达量在所有条件下以热图的形式显示。使用每个条件下每个基因相对于30天常规条件的平均值来计算样本水平的倍数变化（log2）。数据由无监督聚类（pheatmap）组织显示。实验条件表示在每一列的底部；Y轴代表4577个基因。右上角显示倍数变化的颜色键。
图4. 衰老分类器基因的基因本体分析及常规与无菌条件的比较
(A) 维恩图显示了传统（黑圈）和无菌（橙圈）苍蝇之间共同的衰老分类器的数量。显著性由超几何分布测试评估：http://nemates.org/MA/progs/overlap_stats.html。在此图中，常规条件下的分类器仅根据10天、30天和45天的数据进行选择，以方便与无菌数据的比较。
(B)比较常规饲养的苍蝇与无菌饲养的苍蝇的衰老分类器基因列表中生物过程(BP)明显富集的基因本体(GO)组。分类器基因的完整列表见表S8，属于各个生物过程的基因见表S9。热图是基于DAVID的富集分数，每个单元格中的数值是DAVID计算的p值；标有'---'的单元格没有富集。）
(C) 与各自30天龄的条件相比，在10天大的常规（黑条）和无菌（红条）饲养的苍蝇中，显著富集（P≤0.05）的基因上调的生物过程条目。与应激反应相关的生物过程以紫色突出显示。用于分析的基因的完整列表见表S10，属于个别生物过程的基因见表S11。
(D) 与各自30天龄的条件相比，在45天龄的常规（黑条）和无菌（红条）饲养的苍蝇中，明显富集（P≤0.05）的基因上调的生物过程条目。与免疫有关的生物过程以紫色突出显示。用于分析的基因的完整列表见表S10，属于个别生物过程的基因见表S11。
图5. 常规条件下与无菌条件下转录组衰老率的比较
对在常规或无菌条件下分别选择的年龄分类基因进行了比较，并确定了共享分类器。利用共享分类器从常规饲养的苍蝇的基因表达数据中建立了转录组年龄（计算年龄）的线性模型，该模型被应用于计算无菌苍蝇的有效转录组年龄。常规样品：复制体为灰色圆圈；平均值为紫色圆圈；标示为SD。无菌样本：复制体为红色圆圈；平均值为蓝色方块；标示为SD。黑线是传统饲养样品的计算年龄与年代年龄的回归线；红色虚线是无菌样品的回归线。斜率差异的意义是用GraphPad Prism的线性回归分析计算出来的。共享老化分类基因的完整列表见表S12。
图6. 无菌生长对宿主生理学表现的影响
在常规或无菌条件下，交配的雄性苍蝇被平行饲养到指定年龄。然后将它们置于指定的压力源下，并在所示的处理时间内测定存活率。在所有的图表中，黑线是传统饲养的苍蝇处理后的存活率曲线，红线是无菌条件下的存活率。图中数值为平均值±SEM；P值表示（Mantel-cox对数检验），括号中表示所用苍蝇的数量。
(A-C)(A)过氧化氢(H2O2, 5%)，存活率曲线显示了5-6个生物重复的数据。(B) 饥饿条件， 生存曲线是用5个生物重复产生的。 (C) 病原体挑战。用针蘸着Erwinia carotovora亚种的活性培养物或无菌对照物刺穿苍蝇的胸部。每个年龄段和条件下都有50只苍蝇被感染，然而，只有那些在刺伤后存活下来的苍蝇被进一步评分。对照组的存活率曲线：紫色虚线表示对传统饲养的苍蝇进行不育刺杀；青色虚线表示对无菌苍蝇进行不育刺杀。每瓶的原始存活数据见表S13。
(D)节律性苍蝇的χ2周期图。野生型常规饲养的或无菌的苍蝇，在12:12的光照：黑暗周期中被置于恒定的黑暗中，活动被监测8天。在每个面板内，每条线显示了一只苍蝇的活动与昼夜节律周期（Qp）在潜在周期范围内（18-30小时；χ2）的相关性。曲线的峰值表示该个体的昼夜节律周期。每个条件下n = 32只苍蝇。
(E）根据周期图，所示年龄和微生物状态的苍蝇中显示有统计学意义的节律行为的部分。有节律的苍蝇的百分比仅根据那些在整个实验中存活的苍蝇来计算。显著性由Fisher's Exact Test计算。
图7. 无菌苍蝇的表达分析揭示了独立于细菌微生物组的衰老过程
(A)10天、30天和45天无菌苍蝇的基因表达数据被用来选择衰老分类基因（189个基因）。这些基因被用来生成一个计算无菌苍蝇年龄的线性模型（红线）。n = 所有样品的五个生物重复。红色圆圈代表单个数据点，蓝色方块代表无菌苍蝇的平均值（蓝线表示SD）。
(B) 使用DAVID对无菌样品的老化分类器进行GO分析。生物过程与图4B所示相同，然而，此图包括分子功能以及KEGG途径。与新陈代谢、感觉、嗅觉和昼夜节律有关的GO过程以蓝色突出显示。X轴代表P值的-log10。
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