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GelMA水凝胶的标准化及性能手册

已有 10286 次阅读 2023-5-7 08:03 |个人分类:论文|系统分类:论文交流

GelMA水凝胶的标准化及性能手册

【题记】作为上一篇生物3D打印成形过程理论的姊妹篇,这篇工作聚焦我们对GelMA水凝胶的理解,工作做了好几年时间,积累了大量的工艺数据,可用于同行参考。本文主要目的还是希望领域内混乱的认知得到改善。想到用荧光GelMA来系统评价体内降解性能上还是灵光一闪的,其他生物材料可参考这个思路

甲基丙烯酰明胶(GelMA)是一种明胶改性的可光固化水凝胶,兼具了良好的生物相容性、优良的成型性能和可调节的物理化学性质,被广泛应用于组织再生、药物递送等领域。近5年来,基于GelMA水凝胶的相关论文超过1.5万篇,已成为再生医学研究中的一个基础耗材

虽然能够在实验室条件下合成GelMA水凝胶,但其性质在不同的合成条件下有很大差异。目前GelMA水凝胶应用中存在问题包括:(1)型号命名混乱,如文献中常用的1M3M5M的命名方式,是根据反应中加入MA的量命名的,合成时条件控制不好,MA接枝到明胶上的比例就会有较大波动,这导致即使是同一个组合成的GelMA批次间也会有很大差异;(2)不能量化导致大量的低水平重复性工作,比如很多论文都测一遍GelMA的力学、流变、细胞相容性等基本性能;(3)作为生物材料,体内降解性能是很重要的指标,现有文献报道的GelMA降解性能有很多互相矛盾的结果。总的来说GelMA缺乏标准让很多研究结果可信度受到质疑,亟需对GelMA进行标准化。

基于多年来EFL团队为全球上千个实验室提供GelMA水凝胶的经验总结,我们提出以GelMA氨基取代率作为GelMA型号的命名方式,这种命名方式的最大优势是氨基取代率可以准确测量,这样可确保同一型号的性能一致性。例如:氨基取代30%,命名为GM30,取代60%就是GM-60。根据经验,我们认为从标准化的角度保留三个型号,即GM-30, GM-60, GM-90即可,其它取代率的性能可以通过这三个型号进行组合。本研究中,我们首先定义了GelMA的命名方式、基本概念和分子网络密度(DMN)。其次,我们使用了两个性质——取代率(DS)和固体含量比(SC),作为确定DMN的主要测量参数。最后,我们从孔隙率、粘度、成型性能、力学强度、溶胀、生物降解和细胞相容性等方面解释了DMN在各种应用中的机制和关系。相关工作Gelatin methacryloyl hydrogel, from standardization, performance, to biomedical application发表于《Advanced Healthcare Materials》。浙江大学机械工程学院何晶、孙元博士生为共同一作,贺永教授为通讯作者。

研究人员通过本文能够对GelMA水凝胶建立系统认知,减少基本性能测试实验量,让研究生从繁琐和重复的预实验中解放出来。的,以统一的命名方式和性能表征方式作为基础,不同团队的实验也能在同一标准下进行评价。

Fig1. 应用GelMA进行3D培养

 

Fig2. GelMA的合成及固化过程

GelMA溶液的交联是一个完整的化学反应,其中双键被激活形成新的键。该过程将不同的GelMA分子相互连接,随着分子量的增加,GelMA溶液从液体转变为凝胶(2B)GelMA水凝胶柔软且富含水分,可作为理想的细胞培养支架及生物墨水。

Fig3. GelMA的表征及取代率分析

   根据GelMA的合成原理,DS是在GelMA合成过程中明胶中氨基被甲基丙烯酸酯基取代的比例。TNBS可以定量测定GelMA (AGM)和明胶(AG)中氨基的数量。GelMADAS可以用下式来测量:

Fig4. 通过调节DSSC的组合可以实现GelMA的性能调控

GelMA的天然化学性质主要由合成和制备决定,包括DSSC,这些性质显著影响GelMADMN,进而决定了GelMA的应用性能。因此,DSSC是控制GelMA性能的两个重要参数,可以方便地实现具有不同DSSCGelMA

 

 

Fig5. GelMA的孔隙率

孔隙率的定义是固体中空隙的百分比。孔隙率是表征DMN的一个关键因素,许多特性都与此特性有关。扫描电镜观察冻干后水凝胶样品是常用的孔隙率评价方法。这种方式可以确定GelMA水凝胶孔隙率的变化,有助于了解DSSC变化对水凝胶孔隙率的影响。然而,冻干受到许多条件的影响。我们以不同的冷冻温度对同一型号样本进行冻干后,发现样品的孔隙率具有明显差异,证实了冻干方法检测孔隙率的不准确性(现有水凝胶孔隙率基本都是以冻干方法表征其孔隙率

Flory-Rehner理论是一种描述聚合物网络(包括水凝胶)膨胀行为与孔隙率之间关系的理论模型。从本质上讲,该理论预测水凝胶的孔径越小,它的膨胀就越小,因为溶剂分子更难穿透网络。另一方面,更大的孔隙会导致更大的膨胀,因为溶剂分子有更多的空间进入。然而,Flory-Rehner理论有一定的假设限制了其在GelMA网络分析中的应用。因此,Flory-Rehner方程不能提供GelMA孔隙率和膨胀行为之间的精确理论关联。但GelMA的孔隙率和膨胀行为之间的相关性仍然是相关的。它可以提供对GelMA的内在DMN的基本理解。

我们还应用共聚焦技术尝试对GelMA孔隙进行观察(多孔GelMA作为对照),遗憾的是,即使应用100x物镜观察仍很难发现GelMA中的孔隙。而多孔GelMA具有明显的孔隙形成,我们建议很多场景下选用多孔GelMA(EFL-GM-PR系列)作为优化的细胞培养材料。

Fig 6. GelMA的粘度

粘度是表征GelMA墨水 3D打印性能的重要指标。它是指流体在外力作用下流动的阻力。GelMA的粘度可以通过调节DSSC、温度和剪切速率来控制。遗传于明胶的温敏性使GelMA粘度随温度升高而降低。GelMA表现出剪切变稀的行为,这意味着它的粘度在更高的剪切速率下降低。

水凝胶的粘度性能是3D细胞负载打印中实现生物打印组织内均匀细胞分布的关键设计考虑因素之一。低粘度的生物墨水会导致细胞沉降和细胞均匀性差,而高粘度的生物墨水通过提高作用在细胞上的重力和实现中性浮力来确保良好的细胞均匀性。挤出生物打印是一种对高粘度和剪切薄化材料有要求的载细胞打印的好方法。由于GelMA的温度敏感性,预冷却GelMA可以帮助在挤压过程中稳定细胞和水凝胶,然后在生物打印后立即进行紫外线交联,以生成设计的结构。

Fig7. GelMA的成型性和可打印性

成形性是指水凝胶在交联后保持其所需形状,并在使用过程中保持其形状的能力GelMA的双交联特性,温敏性和光敏性,赋予了成形的高自由度。温敏性继承自明胶,高温溶解,低温凝胶。这种特性是可逆的。GelMA的光敏性源于MA接枝,形成了由自由基触发的稳定的共价结合聚合物网络。与温度作用下的物理交联不同,共价交联本质上不是可逆的。共价水凝胶稳定性的提高使其能够与多种组织类型进行物理匹配,使其在更宽的温度范围内充当比纯物理水凝胶更机械坚固的支架。GelMA3D培养和生物打印中的成型性是由它的温度敏感性和光敏性同时决定的。

可打印性是3D生物墨水的重要评价参数。为了评价GelMA的可打印性,我们采用了水凝胶打印的标准化评价方法。采用投影生物3D打印技术(PBP)打印固定在平面圆柱形基座上的中心自由基图案,评估10% GM-30/60/90的打印精度。打印了复杂的拓扑结构,以评估其可打印性和可成形性。可知成型性随DS的增加而提高。双交联特性是GelMA3D打印中应用于构建复杂结构的基础。

 

Fig8. GelMA的机械性能

水凝胶的机械强度是决定其最终强度的关键因素,其定义为试样在断裂(脆性)或屈服(非脆性)之前所承受的最大压应力GelMA的优点之一是可以通过一定的因素(DSSC、光引发剂用量)来调整其机械性能,这些因素直接对应于生物打印在体外和体内的后续应用。本文将DSSC作为调节GelMA机械性能的两个主要可控因素。此外,机械强度调谐是一个热门话题。通过调整合成工艺或添加各种生物材料,可以通过改变DSSC来微调GelMA的压缩模量。

Fig9. GelMA的溶胀性能

溶胀是水凝胶的基本性质,反映了它们吸收溶剂和体积增加的能力。这个过程主要是由焓驱动的,因为链的拉伸导致熵的减少和弹性收缩的发展。当两种相反的力达到膨胀平衡时,最终达到溶胀平衡。光交联水凝胶可以容纳大量的水,这赋予了GelMA优异的膨胀性能,类似于软组织。这一特性直接影响营养物质和废物的运输,与细胞的存活和增殖密切相关。

 

Fig10. GelMA的体内体外的降解性能

在再生医学应用场景中,生物降解性与植入材料被人体吸收有关,这是GelMA应用的一个重要考虑因素。降解太快可能无法为增殖细胞提供足够的支撑,而降解太慢可能导致炎症反应和纤维化。因此,GelMA的降解性能很重要降解程度受DMN的影响,降解速率随着整个分子网络内交联共价键数量的增加而降低。

以往,体内降解性能是通过在不同时间点牺牲动物,获得降解曲线来评估的。这种方法需要消耗大量的实验动物和时间。遵循替代、减少、精炼动物实验的3R原则,我们应用荧光GelMAEFL-GM-RF/GF/BF系列)结合小动物成像技术,监测GelMA的体内荧光信号变化,半定量分析了GelMA的体内降解过程

GelMA的体内和体外降解是相似的。早期双键保持稳定性。高强度的GelMA在体内和体外都具有较高的稳定性。然而,随着网络的瓦解,GelMA被降解吸收。虽然体内研究揭示了降解过程,但由于人体高度复杂,将体外和体内降解结论性地联系起来仍然很困难。

Fig11. GelMA生物相容性

细胞相容性是细胞对所用材料的反应。作为ECM模拟物,GelMA提供了高含水量和低细胞毒性的3D环境,支持基本的细胞功能。3D培养下细胞具有较好的活性,并保持分化的能力。GelMA的蛋白质骨架含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列,使其成为细胞粘附的理想选择这种性能适用于不利于细胞加载的生物打印方法。然而,与稳定的培养皿相比,GelMA代表了细胞的不同环境,因为某些性能会随着时间的推移而变化。例如,膨胀行为引起的形状变化,以及在培养过程中机械强度的变化。GelMA的框架为细胞粘附提供了支持性基质,并促进了促进细胞增殖和分化的生物、化学和物理信号的传递。总之,GelMA为各种生物医学应用提供了一个通用的平台。

最后,我们给出了以3D打印技术和不同应用下的GelMA性能优先性评价,在开发特定3D培养及墨水配方时可以作为参考

Table 1. 3D打印技术中GelMA性能优先性评价

3D printing techniques

Porosity

Mechanical strength

Viscosity

Formability

Swelling

Degradation

Cytocompatibility

Extrusion printing

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Projection-based 3D bioprinting (PBP)

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Laser based two photon polymerization   (TPP)

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Inkjet printing

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Suspension bath printing

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Table 2. 不同应用下GelMA性能优先性评价

Applications

Porosity

Mechanical   strength

Viscosity

Formability

Swelling

Degradation

Cytocompatibility

Tissue   Engin-eering

Bone/

Cartil-age

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Muscle

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Skin

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Brain/

spine   cord

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Drug/gene   Delivery

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3D   culture

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Organ-on-a-Chip

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Biosensors

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Intelligent   Hydrogel

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总结

我们根据DS的变化定义了不同类型的GelMA,并提出了一个标准化的公式,以标准化并规范其使用。我们还对GelMA的基本性质和各种性能进行了系统的分析,表明通过控制DSSC来调控DMN,可以合理方便地获得所需的性能。

论文链接:http://doi.org/10.1002/adhm.202300395

 

 

 

 




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