生物3D打印用光固化水凝胶的成形理论

147 Formation Theory and Printability of Photocurable Hydrogel for 3D Bioprinting.pdf

由于光固化生物水凝胶具有良好的成形性和生物相容性，近年来生物墨水逐渐从第一代的离子交联过渡到第二代的光交联。然而，水凝胶与传统聚合物具有截然不同的聚合特性，业界对水凝胶的光固化过程缺乏量化认知。如何定量化的评价固化及打印后的质量目前缺乏理论的支撑。如，打印过程中有多少单体发生了交联？固化过程中的链式反应步数能否准确统计？交联度该如何定义？

EFL团队多年来一直致力于生物3D打印的研究，在为全球上千个实验室提供光固化生物墨水时，我们意识到理解和量化水凝胶的光交联过程非常重要，否则，生物3D打印就难以实现规模化和标准化。由于缺乏成形理论支撑，目前可印性分析还停留在原料配比、曝光参数优化等表观层面。

因此，EFL团队经过数年的持续攻关，以光聚合生物水凝胶为例，构建了光敏水凝胶的成形理论。我们根据所消耗的双键对成形贡献度不同，定义了三类交联反应，并进一步引出有效双键转化率(Effective double-bond conversion，EDBC)的概念。在EDBC的基础上，定义了系列成形指标。根据成形理论预测出水凝胶的交联行为，并提出了生物水凝胶PBP的新策略。相关工作“Formation theory and printability of photocurable hydrogel for 3D bioprinting” 发表于Advanced Functional Materials。浙江大学机械工程学院何超凡、孙元、刘念博士生为共同一作，贺永教授为通讯作者。

传统聚合物的相关研究已有近百年的历史，其固化交联过程已经非常清楚。然而作为新兴的生物材料，水凝胶具有许多不同于传统聚合物的性质。例如：传统小分子线性聚合为大分子形成一维线性结构单元，而水凝胶是单体大分子通过侧链聚合形成二维网络结构单元；传统聚合物官能化程度通常较高（70-90%），而水凝胶中官能团复杂，仅有一小部分用于交联，因此通常官能化程度较低（＜20%）；传统聚合物多为本体聚合（可视作浓度为100%），而水凝胶为溶液聚合（浓度＜10%)。这些特性使得水凝胶的可打印性不佳，并且很难评估其成形状态。

       由于交联过程的复杂性，目前很少有研究评估水凝胶的成形过程与成形状态，甚至无法准确定义“交联度”这一基本概念。目前水凝胶“交联度”的测试方法有三类，第一类直接通过反应物的浓度描述“交联度”；第二类通过测试水凝胶的力学强度、溶胀率等应用性能进行反向推导，但由于水凝胶官能团繁多，测试方法的不同很容易带来巨大误差；第三类则是通过官能团（例如双键）的转化率来描述“交联度”，双键转化率（Double bond conversion， DBC）用于描述传统小分子是较为准确的，但水凝胶的固化行为却截然不同。因此，需要建立针对水凝胶光固化成形的理论来更全面、准确地评价成形状态。

图1 水凝胶与传统聚合物的不同特性

       因此，我们先区分了水凝胶光交联中三种典型的聚合反应，并且提出在三种反应中消耗的碳碳双键对聚合的贡献是不同的。其中对成形贡献最大的链式反应在水凝胶中的占比通常低于30%，这也是水凝胶成形差的根本原因之一。基于这一现象，我们提出了EDBC的新概念，并且以目前生物3D打印中最常用的光引发剂LAP为例，演示了EDBC的测试与计算方案。

图2 三种聚合反应与EDBC

在EDBC的基础之上，进一步建立了四项成形指标来描述水凝胶的成形状态，给出了相应的测试计算方案。

1.      链式反应平均步数(ACS)：侧面描述了增长反应的占比，可以帮助研究者直观的理解水凝胶的成形性能。大分子生物水凝胶的链式反应步数通常小于10²，而传统的小分子聚合可达10³-10⁵，这也是水凝胶成形性不佳的根本原因之一。

2.      交联度（DGC）：交联反应的完成度，交联度越接近100%，代表交联反应进行的越彻底，可用于指导曝光参数的优化以及水凝胶性能的调节。

3.      交联密度（DSC）：大分子生物水凝胶中交联键占总结合键的比值，交联密度越高代表水凝胶的力学性能越强，可用于指导水凝胶的材料设计。

4.      分子网络密度（DMN）：描述水凝胶交联后的分子网络密度，可用于综合对比不同水凝胶的性能。

图3 成形指标的定义 

       根据成形理论的分析，水凝胶的交联度正比于增长反应与终止（封端）反应的比例，结合化学反应动力学的分析，可以得出：在充分交联的情况下，水凝胶的交联度反比于体系中自由基的浓度。结合引发剂分解速率方程，在3D打印的过程中通过光强来调控自由基浓度最为便捷，因此我们提出了“慢交联效应”，即相同辐照剂量下，通过降低辐照功率可以提高水凝胶的交联上限。

图4 慢交联效应 

为验证成形理论和慢交联效应，将不同分子量和官能化程度的水凝胶在不同曝光条件下进行固化，分别测试快-中-慢交联水凝胶的力学强度、溶胀率、降解率等性能。为排除DBC不同导致的差异，三种曝光条件都具有相等且过量的辐照剂量。结果显示慢交联水凝胶的力学强度最高，溶胀率也最小，且与快交联差异明显。进一步的，计算出三种水凝胶的成形指标，发现均有明显差异。而使用DBC则无法解释这一现象。此外，快交联水凝胶中交联链分子量的计算值为2218 Da，这与测试值1800 Da非常接近；同样地，慢交联的计算值（7768 Da）也与测试值（11081 Da）非常接近。并且水凝胶的分子网络密度与杨氏模量也呈现良好的线性关系。这表明成形理论能够很好的预测水凝胶的成形行为和成形状态。

图5 不同曝光参数下水凝胶的成形状态

图6 F-S打印策略

结合水凝胶的光交联-流变特性分析，我们发现水凝胶在凝胶点前后具有不同的性质。交联前期以增长反应为主，交联度迅速上升；而在交联后期以终止反应为主，交联度上升缓慢。因此可以在凝胶点前后采取不同的交联策略，以实现交联质量与效率的平衡。因此我们提出了快交联打印-慢交联后处理（F-S printing）的PBP策略，能够显著提高打印精度、效率、力学强度和细胞活性。

图7 F-S打印生物应用 

       不同的3D生物打印或生物制造过程可以直接或间接调节细胞的生理生化状态。打印策略的差异通过重建具有不同机械性能的微环境来决定细胞命运。通过改变后处理的曝光参数，F–S打印可以进一步调整固化水凝胶中的交联度和机械性能，从而调节细胞命运。

原文链接：https://doi.org/10.1002/adfm.202301209