用于基因编辑的开关

诸平

New CRISPR method acts as an on-off switch for gene expression.

Credit Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

据伊娃·弗雷德里克（Eva  Frederick）2021年4月9日通过怀特海德研究所（Whitehead Institute）网站提供的消息，在过去的十年中，CRISPR-Cas9基因编辑系统彻底改变了基因工程，使科学家能够对生物体的DNA进行有针对性的改变。尽管该系统可能潜在地用于治疗多种疾病，但CRISPR-Cas9编辑涉及切割DNA链，从而导致细胞遗传物质的永久改变。

现在，研究人员于2021年4月9日在《细胞》（Cell）杂志网站上的一篇论文中，描述了一种称为CRISPRoff的新基因编辑技术，该技术可使研究人员以高特异性控制基因表达，同时保持DNA序列不变。详见James K. Nuñez, Jin Chen, Greg C. Pommier, J. Z. Cogan, Joseph M. Replogle, Carmen Adriaens, Gokul N. Ramadoss, Quanming Shi, King L. Hung, Avi J. Samelson, Angela N. Pogson, James Y.S. Kim, Amanda Chung, Manuel D. Leonetti, Howard Y. Chang, Martin Kampmann, Bradley E. Bernstein, Volker Hovestadt, Luke A. Gilbert, Jonathan S. Weissman. Genome-wide Programmable Transcriptional Memory by CRISPR-based Epigenome Editing. Cell, online April 9, 2021. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.025

该方法由怀特海德研究所（Whitehead Institute）成员乔纳森·魏斯曼（Jonathan Weissman）、美国加利福尼亚大学旧金山分校（University of California San Francisco）助理教授卢克·吉尔伯特（Luke Gilbert）、乔纳森·魏斯曼实验室的博士后詹姆斯·努涅斯（James K. Nuñez）以及合作者设计，该方法足够稳定，可以通过数百个细胞分裂进行继承，并且是完全可逆的。怀特海德研究所是位于美国马萨诸塞州剑桥市的非营利性研究机构，致力于通过基础生物医学研究来改善人类健康。它是作为麻省理工学院（MIT）的一个独立于财务的实体而成立的，其18名成员均在MIT生物工程系或MIT生物工程系任职。

乔纳森·魏斯曼是此项研究成果的通讯作者，他同时也是麻省理工学院的生物学教授和霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。他说：“这里最重要的是，我们现在拥有一个可以沉默绝大多数基因的简单工具。我们可以同时对多个基因进行此操作，而不会造成任何DNA损伤，并具有很高的同质性，而且可以逆转。这是控制基因表达的好工具。” 

该项目部分由美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency）于2017年提供的资金，用于创建可逆基因编辑器。共同通讯作者卢克·吉尔伯特说：“从最初的拨款开始，已经快了4年，而CRISPRoff终于按照科幻小说的方式工作了。” “看到它在实践中如此出色，真是令人兴奋。” 

基因工程2.0（Genetic engineering 2.0）

经典的CRISPR-Cas9系统使用一种在细菌免疫系统中发现的称为Cas9的DNA切割蛋白。该系统可以使用单个向导RNA靶向人细胞中的特定基因，其中Cas9蛋白在DNA链中产生微小的断裂。然后，细胞现有的修复机器就会修补这些漏洞。

由于这些方法会改变基本的DNA序列，因此它们是永久性的。另外，它们依赖于“内部”细胞修复机制，这意味着很难将结果限制为单个所需的改变。乔纳森·魏斯曼说：“尽管CRISPR-Cas9很漂亮，但它可以帮助修复复杂而多面性的自然细胞过程，而结果却很难控制。”

在这里，研究人员看到了一种不同类型的基因编辑器的机会——一种不改变DNA序列本身，而是改变它们在细胞中的读取方式的基因编辑器。

这种修饰被科学家称为“表观遗传基因”( “epigenetic”-genes)，它可能会因DNA链的化学变化而被沉默或激活。细胞表观遗传学(cell’s epigenetics)的问题是导致许多人类疾病的原因，如脆性X染色体综合症（Fragile X syndrome）和各种癌症，而且可以代代相传。

 表观遗传基因沉默往往是通过甲基化的化学标记某些地方的DNA链，导致DNA变得无法进入RNA聚合酶（RNA polymerase）,这种酶能将DNA序列中的遗传信息读取到信使RNA转录本中，而信使RNA转录本最终可以成为蛋白质的蓝图。

乔纳森·魏斯曼和合作者以前曾创建过另外两个被称为CRISPRi和CRISPRa表观遗传编辑器（epigenetic editors），但两者都有一个警告。为了使它们在细胞中发挥作用，细胞必须不断表达人工蛋白质来维持这些变化。

“由于我们现在可以使我们想要的基因组的任何部分保持沉默，因此它是探索基因组功能的绝佳工具。”

卢克·吉尔伯特说：“有了这种新的CRISPRoff技术，你可以(简单地表达一种蛋白质)编写一个程序，该程序可以被细胞记住并无限期地执行。它改变了游戏规则，所以现在你基本上是在写一个通过细胞分裂传递的变化。在某些方面，我们可以学习创建一个更安全有效的CRISPR-Cas9 2.0版本，不仅可以完成所有这些工作，还能做些其他事情。” 

构建开关（Building the switch）

为了构建一个可以模仿天然DNA甲基化的表观遗传编辑器，研究人员创建了一个微型蛋白质机器，该机器在小RNA的引导下可以将甲基粘在链的特定点上。这些甲基化的基因随后被“沉默”或关闭，因此命名为CRISPRoff。

因为该方法不会改变DNA链的序列，所以研究人员可以使用去除甲基的酶来逆转沉默效果，他们将这种方法称为CRISPRon。 

当他们在不同条件下测试CRISPRoff时，研究人员发现了新系统的一些有趣功能。一方面，他们可以将这种方法针对人类基因组中的绝大多数基因—它不仅对基因本身有效，而且对控制基因表达但不编码蛋白质的DNA其他区域也有效。第一作者詹姆斯·努涅斯（James K. Nuñez）说：“即使对我们来说，这也是巨大的打击，因为我们认为它仅适用于一部分基因。”

此外，令研究人员惊讶的是，CRISPRoff甚至能够让没有大型甲基化区域(称为CpG岛)的基因沉默，CpG岛(CpG islands)此前被认为是任何DNA甲基化机制所必需的。

卢克·吉尔伯特说：“在进行这项工作之前，人们曾想过，没有CpG岛的基因中有30％不受DNA甲基化的控制。” “但是我们的工作清楚地表明，您不需要CpG岛即可通过甲基化关闭基因。对我来说，这是一个很大的惊喜。”

CRISPRoff在研究和治疗中的应用(CRISPRoff in research and therapy)

为了研究CRISPRoff在实际应用中的潜力，科学家在诱导多能干细胞中测试了该方法。这些细胞可以根据其所接触的分子的混合物在体内转化为无数种细胞，因此是研究特定细胞类型的发育和功能的强大模型。

研究人员选择了一种在干细胞中沉默的基因，然后诱导它们转变为称为神经元的神经细胞。当他们在神经元中寻找相同的基因时，他们发现该基因在90％的细胞中都保持沉默，这表明即使改变细胞类型，细胞也保留了CRISPRoff系统进行的表观遗传修饰的记忆。

他们还选择了一个基因作为CRISPRoff如何应用于治疗的一个例子：编码Tau蛋白（Tau protein）的基因，该基因与阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease）有关。在神经元中测试了该方法之后，他们能够证明使用CRISPRoff可以降低Tau蛋白的表达，尽管不是完全关闭。乔纳森·魏斯曼说：“我们证明，这是沉默Tau蛋白并阻止该蛋白表达的可行策略。问题是，然后，您如何将其交付给成年人？真的足以影响阿尔茨海默氏症吗？这些是悬而未决的大问题，尤其是后者。”

即使CRISPRoff没有带来阿尔茨海默氏症的治疗方法，它也有可能应用于许多其他疾病。

乔纳森·魏斯曼说，尽管CRISPRoff等基因编辑技术对特定组织的传递仍然是一个挑战，但“我们证明，你可以将其作为DNA或RNA瞬时传递，这种技术也是现代RNA和生物技术冠状病毒疫苗的基础。”

乔纳森·魏斯曼、卢克·吉尔伯特以及合作者也对CRISPRoff的研究潜力充满信心。乔纳森·魏斯曼说：“因为我们现在可以使我们想要的基因组的任何部分保持沉默，所以它是探索基因组功能的好工具。”

另外，拥有一个可靠的系统来改变细胞的表观遗传学，可以帮助研究人员了解表观遗传学修饰通过细胞分裂传递的机制。“我认为我们的工具确实使我们能够开始研究遗传力的机制，尤其是表观遗传力，这在生物医学科学中是一个巨大的问题，”詹姆斯·努涅斯说。上述介绍仅供参考，更多信息敬请注意浏览原文或者相关报道。

Highlights

• CRISPRoff is a single fusion protein that programs heritable epigenetic memory

• CRISPRoff can heritably silence most genes, including genes without CpG islands
  

• CRISPRoff is highly specific and has a broad targeting window across gene promoters
  

• CRISPRoff epigenetic memory persists through differentiation of iPSCs into neurons
  

Summary

A general approach for heritably altering gene expression has the potential to enable many discovery and therapeutic efforts. Here, we present CRISPRoff—a programmable epigenetic memory writer consisting of a single dead Cas9 fusion protein that establishes DNA methylation and repressive histone modifications. Transient CRISPRoff expression initiates highly specific DNA methylation and gene repression that is maintained through cell division and differentiation of stem cells to neurons. Pairing CRISPRoff with genome-wide screens and analysis of chromatin marks establishes rules for heritable gene silencing. We identify single guide RNAs (sgRNAs) capable of silencing the large majority of genes including those lacking canonical CpG islands (CGIs) and reveal a wide targeting window extending beyond annotated CGIs. The broad ability of CRISPRoff to initiate heritable gene silencing even outside of CGIs expands the canonical model of methylation-based silencing and enables diverse applications including genome-wide screens, multiplexed cell engineering, enhancer silencing, and mechanistic exploration of epigenetic inheritance.