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提示：爱好生物学的可从第一段读起，爱好“青稞”（青科）靓照和辛酸故事的请直奔最后部分。如果你看多了那些神人神操作的故事，或许在我们普通人之间对于科研和职业精神的朴实理解更有惺惺相惜的感觉。
地球上最冷的区域当数南极大陆。那里最低气温可达到-89.2oC，约有99.8%的面积被平均2公里厚的冰层覆盖（图1）。虽然如此，在没有冰盖的区域地表温度常年在-35oC ~ 5oC范围内波动。南极的动植物生活在有季节性融水的无冰盖区域，而微藻和其他微生物则不仅生活于这些区域，还能生活于雪地、海冰和封存于冰盖之下的湖泊之中。南极与其他大陆的动植物群落相互隔绝，但是其他大陆的微生物却可以通过大气层流等途径达到南极。
图1. 南极正面观。一些山脊（右上角图）和海岸带（右下角）有裸露的陆地（网络下载图片）
南极为何如此寒冷？在地质史上，南极是从冈瓦纳大陆分离出来的。约在3400万年到3300万年前，CO2浓度和气温骤降，冰层覆盖南极。约2300万年前，南极洲与南美洲完全断开，成为孤立的大陆，环南极洋流隔断了南极与外界的热量交换。较少的太阳辐射、冰层的反射加上洋流的隔温作用，导致南极成为地球上最为寒冷的区域。随大陆漂移带去南极的嗜温微生物在经历地质史上迅速冷却的时期后可能成为嗜冷微生物；另一方面，后来被大气层流转移到南极的微生物也可能演化出抗冻能力和在低温下生长的能力。
生活在无冰盖地区的南极微生物需要在冰冻时期保持存活力，在0oC左右温度时保持细胞活性和生长能力。抗冻能力主要依靠冰晶结合蛋白和LEA蛋白（最早发现于植物胚胎发育晚期，称为Late Embryogenesis Abundant protein，后发现于其他各类生物）的作用；有关细胞如何在低温下保持生化反应速率，目前认为主要是基于冷适应酶或嗜冷酶的作用。与同源的嗜温酶相比较，嗜冷酶积累了一些突变，导致蛋白整体结构或活性位点周围结构柔性增加、催化反应最适温度降低（图2）。但是，积累这类突变需要较长的时期，细胞在低温下的生长又需要许多酶都获得冷适应。因此，在酶获得冷适应之前，细胞如何尽快获得生长能力，成为温带微生物适应南极环境的关键环节，也是一个尚未解答的重要问题。
图2. 嗜冷酶(蓝色)与同源的嗜温酶(红色)温度适应性的差异
大约20年前，本实验室从南极中山站附近一处季节性积水的石块上分离到小球藻（Chlorella vulgaris）NJ-7（图3），其18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA序列与从北温带分离到的小球藻UTEX259完全一样，ITS2和28S rRNA也仅各有2~3 bp的差异，应为同一种。两个藻株在20oC时生长几乎没有差异，但在4oC时只有NJ-7能够生长；NJ-7比UTEX259在-20oC的抗冻力也有大幅提高（图4）。光合作用的温度适应性进一步显示NJ-7实际上是一个嗜温藻株，只是已发展出在低温下的生长能力。
图3. 小球藻南极株显微照片和在冰箱中生长的情形
图4. 小球藻南极株NJ-7和温带株UTEX259抗冻力（小柱形图）和低温生长能力的差异。 (a) 在20oC条件下生长；(b) 在4oC条件下生长（参考文献1）
为了分析小球藻适应南极的机理，我们对两个藻株进行了全基因组序列分析。核基因组共线性分析，以及叶绿体、线粒体基因组结构都支持二者为同一物种。它们的叶绿体基因组基因组成相同，除两处颠倒外基因排列十分一致；线粒体基因组的基因组成和排列均一致。由于非编码区的差异，南极株两种细胞器基因组均小于温带株。以36个共同的叶绿体基因构建以植物化石作年代标记的绿藻演化系统关系树（图5），推算出小球藻NJ-7和UTEX259的分离时间约在260万年（95%置信限110 ~ 440万年）前，远远晚于南极洲与南美洲分离的时间。因此，小球藻南极株应该是自温带转运过去的。
图5. 以植物化石为年代标记的绿藻系统关系树（参考文献1）
小球藻的抗冻能力与其LEA蛋白的丰度密切相关。本实验室曾发现小球藻的两种新型LEA蛋白，称为Ccor1和Ccor2。表达纯化这两种蛋白，各自加至乳酸脱氢酶溶液，可防止冻融对酶活性的破坏（图6）。在获得全基因组信息后，我们进一步开展了LEA蛋白基因的系统挖掘，在NJ-7和UTEX259分别发现了23个和22个LEA蛋白基因，其中一些在染色体上串联排列，有的单独存在（图7a）。一些在染色体上串联的基因在系统关系树上成簇分布（图7b），提示这种基因丛可能是通过基因加倍的方式形成的。预测显示，这些LEA蛋白分布于小球藻细胞的核和细胞器、胞浆、质膜等部位，负责在冰冻条件下保护不同部位的酶免受破坏（图7a）。
图6. 小球藻LEA蛋白Ccor1和Ccor2在冻融条件下对乳酸脱氢酶的保护作用。加不同浓度Ccor1, Ccor2或其他
对照至乳酸脱氢酶（LDH）溶液，经冻融处理之后残留的LDH活性（参考文献2）
图7. 小球藻LEA蛋白基因在染色体上的分布（a）和系统关系（b）。（b）中还预测了LEA蛋白在细胞内的分布（参考文献1）
转录组和定量蛋白组学分析表明，无论在20oC还是4oC条件下，NJ-7中都有若干LEA蛋白显著高于UTEX259中相应蛋白的水平（图8）。这些LEA蛋白的积累是与小球藻南极株抗冻力的显著提高相一致的。
图8. 在转录组和蛋白组数据中NJ-7和UTEX259的LEA蛋白的差异表达。星号指示mRNA水平的显著差异。hiC6不同
拷贝在蛋白和mRNA水平难以区分，Ccor1和Ccor2在蛋白水平难以区分，故合并统计（参考文献1）
那么，小球藻南极株如何在4oC条件下维持细胞活性、获得生长能力呢？首先以硝酸还原酶为例进行研究（图9）。比较NJ-7和UTEX259的硝酸还原酶，发现最适温度没有显著偏移，是典型的嗜温酶，但NJ-7的硝酸还原酶活性（比活性不变）显著高于UTEX259，可能是由硝酸还原酶的含量造成的。Western blot分析证明NJ-7中的硝酸还原酶含量确实显著高于UTEX259，与酶活性差异相吻合。定量蛋白组分析显示出硝酸还原酶和亚硝酸还原酶都在NJ-7中显著增加。这两种酶在蛋白水平的增加使得小球藻可在4oC利用硝酸盐。
图9. 硝酸还原酶和亚硝酸还原酶在NJ-7和UTEX259的差异表达。（a）NJ-7和UTEX259的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶中存在的
少量置换突变（红点）；（b）NJ-7和UTEX259中硝酸还原酶丰度和温度适应性的比较;（c）硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因
在转录组和蛋白组数据中显示的差异表达。定量蛋白组学方法对蛋白含量差异存在低估，1.3倍约相当于Western blot显示出的
2倍以上差异（参考文献1）
定量蛋白组学分析还显示，许多与碳代谢相关的酶，譬如一些参与多糖、寡糖的水解和再利用的酶，参与糖酵解途径的酶，在NJ-7中的水平都显著高于UTEX259（图10）。在生化反应途径中，限速步骤的酶对于反应途径的总体速率起关键作用，这些酶显著增多就可能使生化反应在4oC保持活跃。在NJ-7中，有400余种酶/蛋白的水平都显著高于UTEX259，这些酶/蛋白含量的增加使NJ-7在低温下得以维持生命活动，促进其生长。
图10. 参与碳代谢的部分酶在NJ-7和UTEX259中差异表达的情况。橘黄色框表示在NJ-7中比在UTEX259中含量显著增加的酶（参考文献1）
生物对于寒冷的适应有两个不同的概念：一个是cold acclimation，是指将生物体从适宜温度转移到低温下引起的生理生化响应，是以基因表达调控为基础的；另一个是cold adaptation，是指生物历经多代处于低温环境导致适应性演化，是以积累遗传突变为基础的。蛋白组和转录组数据比较显示，cold acclimation引起小球藻许多基因的差异表达，大多数在蛋白和mRNA水平相一致，而两个藻株之间的差异（包括cold adaptation、其他适应和遗传漂变，但cold adaptation可能起主要作用）在蛋白和mRNA水平大多不一致，显示在NJ-7演化过程中酶/蛋白含量的增加主要是在翻译或翻译后水平引起的（图11）。在蛋白水平比较cold acclimation引起的NJ-7表达差异与藻株之间在4oC的表达差异，发现重叠很少（图12）。绝大多数在NJ-7细胞中含量提高的酶/蛋白都是不受低温诱导表达的。这是由于响应cold acclimation的调控表达主要是缓解低温生理胁迫，不是形成在4oC的生长能力，而小球藻的种内演化导致NJ-7获得在4oC的生长能力，两者所涉及的基因范围差别较大。
图11. 转录组与蛋白组数据之间以及蛋白组数据之间上调表达基因的重叠关系。（a）藻株在4oC和20oC条件下的差异表达；（b）在4oC或20oC条件下两藻株之间的差异表达；（c）定量蛋白组分析显示的基因差异表达重叠关系。Prot.，蛋白组数据；RNA，转录组（RNA-seq）数据（参考文献1）
图12. 对cold acclimation与cold adaptation关系的图示。图中数字为NJ-7在4oC比在20oC时表达水平显著上调的蛋白数（绿色）
和在4oC 条件下NJ-7比UTEX259含量显著增加的蛋白数（棕色）。表达下调与含量减少的蛋白之间的重叠关系与此类似
除了蛋白水平的差异以外，NJ-7相对于UTEX259也有一些酶存在正向选择，这种正向选择最终可能导致嗜冷酶的形成。譬如，植物细胞膜的外半层富含鞘脂，鞘脂脱饱和酶的表达与植物抗寒能力相关。小球藻NJ-7的鞘脂脱饱和酶不仅受低温诱导表达、在NJ-7比UTEX259水平更高，而且还存在正向选择，是三项特征叠加的少数酶之一。
基于对小球藻在南极环境下早期适应演化的研究，我们认为微藻和其他微生物对于常年寒冷环境的适应可分为两个过程：一是通过较少的突变尽快使得生化反应途径的关键酶获得积累以提高在低温下的生长能力，同时积累LEA蛋白或者冰晶结合蛋白以提高抗冻能力，获得“生存权”、确定“居民身份”；二是进一步积累冷适应突变，使嗜温酶逐步成为嗜冷酶，提高在低温下酶的比活性，以降低蛋白丰度、减少能量消耗，成为嗜冷物种。第一个过程快，第二个过程慢，虽非截然分开，但在时间上形成两个步骤。这一“两步适应模式”初步解释了温带微生物到达南极等常年低温环境后的早期适应机制。此外，NJ-7和UTEX259是罕见的以百万年计的种内演化例证，本研究也可作为微生物转运到南极后适应性演化的第一个实例研究。
科学部分讲完了，那“青稞”故事呢？当然有啊，先上靓照：
“青稞”王雅丽
王雅丽与孩子
她叫王雅丽，博士毕业当了8年的助理研究员，从读研至今差不多14年时间，这辈子最美好的时光除了献给亲人，就是献给了小球藻，现在还是一个小姑娘的妈妈（看照片，有没有感受到基因的强大？）。
高宏在南极
高宏（右二）在球场
他叫高宏，这辈子最美好的时光献给了亲人和科研，还有篮球和乒乓球，是一个男孩的爸爸，还是党支部书记嘞。他就是20年前去南极采集藻类的人，在这项研究中还参加了小球藻的生理学研究。以下的内容就不说他啦，让上面那个小姑娘的妈妈代表青稞们吧。
王雅丽就是参考文献1的第一作者，她完成了绝大部分生物信息学分析和小部分实验分析工作。十几年前，我们只能通过差减杂交、构建cosmid文库、基因克隆、表达分析等等常规方法做一些分子遗传学研究。8年前，王雅丽就是用小球藻做这样的研究获得博士学位。那时候，测基因组已经是一件时髦的事情，我们要更清楚地理解小球藻怎样适应南极环境，大概只有去基因组里找线索了。王雅丽留在研究所当助理研究员，从学习计算机语言和基因组学分析方法做起，继续开展小球藻适应南极的研究。本来猜想，是不是小球藻通过横向转移途径获得了什么嗜冷菌的基因从而适应南极，可是找到了许多横向转移的基因，却没有发现这些基因跟嗜冷有什么关系，多数基因甚至没有明确功能，没法解释诸多代谢途径为何能够在低温下维持较高活性。如果说根据已有的信息把LEA基因挖掘出来，把两个藻株之间差异之处摆一摆，把小球藻与其他绿藻的相似之处罗列一番，并非不能发表，当时一些不错的刊物也有这类文章，但是对于我们最关心的问题好像就是搔了一下痒，并没有找到答案。
后来，测RNA-seq的技术服务普及了，于是满怀希望地去全基因组的差异表达里找答案。结果发现，不同温度间差异表达涉及的基因有2000个左右，两个藻株间的差异表达基因有900多个，同一个代谢途径往往在两个藻株之间各有基因上调表达，仍然不能帮助我们理解小球藻在低温下的生长能力，唯有LEA蛋白基因的差异表达与藻株的抗冻能力相吻合。而且，mRNA水平的差异表达并不意味着蛋白水平的差异。
这期间，像许多青稞一样，王雅丽也写过基金申请，希望通过实验手段对她挖掘到的20多个LEA蛋白作细胞定位，并分析功能，得到专家的评审意见却是“意义不大”，没有批准。可是，之后国外有实验室在Plant Cell发表了对拟南芥LEA蛋白定位的系统研究。不知专家们后来有没有注意到在Plant Cell发表的这篇论文与他们否定掉的一个青稞的想法是不谋而合的？没有论文发表对于青稞更是莫大的煎熬。实验室也安排王雅丽参加了其他一些项目，总算能有论文发表，但是离竞聘副研究员的要求差距还比较大。
基因组和转录组分析都不能提供足够的信息回答小球藻如何在南极获得繁殖能力的问题，这似乎困住了我们。但是，当我们回顾组学分析之前做过的研究却获得了一丝启发。王雅丽的师姐刘小香（参考文献1的第二作者）曾专门分析过小球藻两个藻株硝酸还原酶的温度适应性和表达差异。她发现，藻株之间硝酸还原酶氨基酸序列和温度适应性差异很小，但是南极株的硝酸还原酶含量要高很多，导致在低温下的酶活性显著提高（比活性不变）。这提示某些关键反应的酶通过蛋白水平的提升维持在低温下的酶活性。要回答这一适应策略是否具有普遍性，需要对两个藻株进行定量蛋白组学分析。终于，定量蛋白组学的技术服务也普及化了，我们可以分析不同温度和藻株之间在蛋白水平的差异表达了。等到数据出来，才发现只有同一藻株在不同温度下的差异可以分析，而不同藻株之间不可以，原因是蛋白序列存在个位数到两位数的氨基酸残基的差异（毕竟已分离260万年之久），软件不能识别为同一蛋白。最后，直到想出把蛋白质切成肽段、提取出相同肽段重新建库的方法才克服了这一困难，实现了两个藻株之间蛋白水平差异表达的组学分析。蛋白组学的分析果然证明了我们的猜想，许多关键的酶在南极株中的含量显著地增加了。等到我们完成全部分析，撰写和修改完论文稿，离王雅丽8年“非升即离”的期限已经只有8个月的时间了。
一个青稞面临“非升即离”的威胁，没有焦虑那是不可能的。王雅丽度过了许多焦虑的日子，但幸运的是，她背后有3位“合作导师”的帮助，论文经过两轮修改终于被接受发表，较为完整地讲述了小球藻怎样适应南极的故事。有这个加分项，加上专注的精神，她得到职称评审专家们的认可，在“非升即离”期限到来前2个月通过了副研究员的竞聘答辩。
在我们这个时代，博士毕业8年的女学者，有的已经是博导，甚至是“帽子人才”。我们固然对那些才能卓著、鸿运当头的青年才俊们赞赏有加，但是也同样为经历漫长的探索仍执着追求的人们由衷地喝彩！科研工作者能像爱亲人一样爱科学，为求真知而甘冒风险，这大概就是我们身为普通科研工作者最可宝贵的精神。
致谢：感谢王雅丽、高宏提供生活和工作照，以及汪红、王雅丽、高宏对本文的阅读和修改意见。
参考文献：
1. Yali Wang, Xiaoxiang Liu, Hong Gao, Hong-Mei Zhang, An-Yuan Guo, Jian Xu, Xudong Xu, 2019. Early stage adaptation of a mesophilic green alga to Antarctica: systematic increases in abundance of enzymes and LEA proteins. Molecular Biology and Evolution, msz273, https://doi.org/10.1093/molbev/msz273
2. Xiaoxiang Liu, Yali Wang, Hong Gao, Xudong Xu, 2011. Identification and characterization of genes encoding two novel LEA proteins in Antarctic and temperate strains of Chlorella vulgaris. Gene, 482: 51-58.
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