当二代测序的原始数据拿到手之后，第一步要做的就是看一看原始reads的质量。常用的工具就是fastqc (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。

fastqc的详细使用说明：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/
我们在服务器上用命令行来运行fastqc：

-o用来指定输出文件的所在目录，注意是不能自动新建目录的。输出的结果是.zip文件，默认自动解压缩，命令里加上--noextract则不解压缩。

-f用来强制指定输入文件格式，默认会自动检测。

-c用来指定一个contaminant文件，fastqc会把overrepresented sequences往这个contaminant文件里搜索。contaminant文件的格式是"NametSequences"，#开头的行是注释。加上-q会进入沉默模式，即不出现下面的提示：
Started analysis of target.fq
Approx 5% complete for target.fq
Approx 10% complete for target.fq

如果输入的fastq文件名是target.fq，fastqc的输出的压缩文件将是target.fq_fastqc.zip。解压后，查看html格式的结果报告。结果分为如下几项：

 
结果分为绿色的"PASS"，黄色的"WARN"和红色的"FAIL"。

“You should treat the summary evaluations therefore as pointers to where you should concentrate your attention and understand why your library may not look random and diverse. ”

1 Basic statistics
如下面例子所示：

 
2 Per base sequence quality
quality就是Fred值，-10*log10(p)，p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率为0.01时，其quality就是20。图像如下面例子：
 
横轴代表位置，纵轴quality。红色表示中位数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间，蓝线是平均数。
若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报"WARN"；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报"FAIL".
3 Per Sequence Quality Scores
每条reads的quality的均值的分布：
 
横轴为quality，纵轴是reads数目。当出现上图的情况时，我们就会知道有一部分reads具有比较差的质量。
当峰值小于27（错误率0.2%）时报"WARN"，当峰值小于20（错误率1%）时报"FAIL"。
4 Per Base Sequence Content
对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）的分布：
 
横轴为位置，纵轴为百分比。 正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。
当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"。
5 Per Base GC Content
对所有reads的每个位置，统计GC含量。
 
如果建库足够均匀，reads的每个位置应当是没有差异的，所以GC含量的线应当平行于X轴，反映样品（基因组、转录组等）的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。
当任一位置的GC含量偏离均值的5%时，报"WARN"；当任一位置的GC含量偏离均值的10%时，报"FAIL"。
6 Per Sequence GC Content
统计reads的平均GC含量的分布。
 
红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。
偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"。
7 Per Base N Content
当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”。对所有reads的每个位置，统计N的比率：
 
正常情况下N的比例是很小的，所以图上常常看到一条直线，但放大Y轴之后会发现还是有N的存在，这不算问题。当Y轴在0%-100%的范围内也能看到“鼓包”时，说明测序系统出了问题。当任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；当任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"。
8 Sequence Length Distribution
reads长度的分布。
 
当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”。
9 Duplicate Sequences
统计序列完全一样的reads的频率。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）。
 
横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。 上图的情况中，相当于unique reads数目～20%的reads是观察到两个重复的，～7%是观察到三次重复的，依此类推。
可以想象，如果原始数据很大（事实往往如此），做这样的统计将非常慢，所以fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重复情况。重复数目大于等于10的reads被合并统计，这也是为什么我们看到上图的最右侧略有上扬。大于75bp的reads只取50bp（不知道怎么选的）进行比较。但由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以其重复程度仍有可能被低估。
当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL“。
10 Overrepresented Sequences
如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fq数据的前200,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加入了-c contaminant file，出现的over-represented sequence会从contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一个mismatch），可以给我们一些线索。
当发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“。
11 Overrepresented Kmers
如果某k个bp的短序列在reads中大量出现，其频率高于统计期望的话，fastqc将其记为over-represented k-mer。默认的k = 5，可以用-k --kmers选项来调节，范围是2-10。出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer被认为是over-represented。fastqc除了列出所有over-represented k-mers，还会把前6个的per base distribution画出来。
 
当有出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer时，报”WARN“；当有出现频率在某位置上10倍于期望的k-mer时报"FAIL"。