转录组测序概述及生物信息学分析流程
2014-11-29 21:30
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三、转录组测序有什么样的样品要求?
(1)样品纯度要求: OD值应在1.8至2.2之间;电泳检测28S:18S至少大于1.8。
(2)样品浓度: totalRNA浓度不低于400ng/μg。
(3)total RNA样品请置于-20℃保存;请提供totalRNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据,包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。
(4)样品请置于1.5 ml管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。
(2)样品浓度: totalRNA浓度不低于400ng/μg。
(3)total RNA样品请置于-20℃保存;请提供totalRNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据,包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。
(4)样品请置于1.5 ml管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。
四、转录组测序需要多大的测序量才能得到有意义的结果?
转录组测序前,需要对物种转录组的大小进行评估,评估方法如下:
(1)对于有reference genome的物种,可以分析基因组信息,统计编码基因的个数,及其碱基数,从而估计物种转录组的大小,另外可以查询相关或相近物种转录组研究的文献,作为参考。
(2)对于无reference genome的物种则只能参考相近物种的转录组大小。
由于转录组需要进行表达量的分析,因此在转录组测序中不推荐覆盖度,在进行不同基因和不同实验间的基因表达差异分析时,人们提出了RPKM和FPKM的概念。RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)是每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM与RPKM计算方法基本一致。不同点就是FPKM计算的是fragments,而RPKM计算的是reads。Fragment比read的含义更广,因此FPKM包含的意义也更广,可以是pair-end的一个fragment,也可以是一个read。因此,在确定转录组的测序量时,最好以产生的读长数目做依据,参照转录组大小,估计需要的读长数目,来确定转录组需要的测序量。
五、转录组测序实验技术路线
六、转录组测序数据分析技术路线
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