肠完整性和粘膜紧密连接的评价

肠上皮细胞间的紧密连接在维持肠膜屏障的完整性中起着重要作用。紧密连接位于侧膜的顶端，由一对跨膜蛋白（如occludins和claudins）组成，与细胞内锚蛋白（如zonula occludens）相互作用，而这些锚蛋白又与肌动蛋白细胞骨架相连。紧密连接是细胞旁渗漏途径的速率限制。组织学是初步评估肠屏障的完整性的方法。苏木精-伊红染色小肠切片的标准光镜检查能够检测到肠道病理，包括粘膜溃疡和严重的肠道炎症，这些炎症将导致和促进肠道通透性增加。

在电子显微镜导致在上皮屏障中发现紧密连接。闭塞小带（紧密连接）的特征是相邻细胞膜与相邻细胞膜的致密外小叶融合，这些小叶汇合形成一条中间线。密集细胞质物质的弥漫带通常与这种连接有关。

采用免疫荧光染色方法，使用针对各种紧密连接蛋白的特异性抗体进行观察。紧连接分子的蛋白质和mRNA转录水平可分别通过western blotting和定量PCR进行评估。紧密连接复合体由多种蛋白质组成。由于单分子对紧密连接的完整性和功能的重要性目前还不清楚，因此可能需要功能分析来阐明它们的作用。

酒精性疾病是在培养和体内评估肠道屏障完整性重要性的一个例子。高浓度乙醇（>40%）的直接细胞毒性作用通过引起血管和粘膜损伤而增加肠道通透性，在苏木精-伊红染色的玻片上最为明显。基于Caco-2单层细胞的研究表明，甚至更低的非细胞毒性剂量的乙醇也可能通过激活肌球蛋白轻链激酶改变紧密连接的结构和功能。分化的肠上皮细胞，如Caco-2细胞，通常用于功能分析紧密连接动力学。除了乙醇，乙醛，乙醇代谢的产物，是紧密连接功能障碍更强烈的诱导剂。乙醇在肠内被氧化成乙醛，乙醛的积累与酒精相关的组织损伤有关。

细菌过度生长可能会增加乙醇氧化为乙醛，并导致乙醛在肠内积聚。由于结肠粘膜和微生物组氧化乙醛的能力较低，乙醛在结肠中积聚，乙醛可能通过酪氨酸激酶依赖机制介导的紧密连接蛋白重新分布，随后增加肠道通透性。Salaspuro在“乙醇氧化的细菌结肠途径：特点和意义”一文中报道，口服的酒精通过血液循环输送到结肠，在分配阶段后，结肠内的酒精水平与血液中的酒精水平相等。他们实验室最近的研究表明，大肠中的乙醇被细菌结肠途径氧化。在这个途径中，大肠内乙醇首先被细菌乙醇脱氢酶氧化为乙醛。然后乙醛被结肠粘膜或细菌乙醛脱氢酶氧化为醋酸盐。部分结肠内乙醛也可被门静脉吸收并在肝脏代谢。细菌结肠途径为部分乙醇热量的消失提供了新的解释。由于结肠粘膜乙醛脱氢酶活性低，乙醛在结肠内积聚。因此，在乙醇氧化过程中，人体内乙醛含量最高的部位是结肠，而不是肝脏。高浓度的结肠内乙醛可能是酒精性腹泻的发病机制之一。因为乙醛在实验动物中是一种致癌物，它也可能导致结肠息肉和结肠癌的风险增加，而这与大量饮酒有关。结肠内乙醛也可能是血液乙醛水平的重要决定因素和可能的肝毒素。除乙醛外，肠源性内毒素在酒精性肝损伤的发病机制中也是一个潜在的候选者。实验性酒精性肝损伤最近被抗生素所预防，这种效果与防止内毒素诱导的枯否氏细胞活化有关。

肝硬化患者的肠道通透性增加通过促进全身内毒素血症在自发性细菌性腹膜炎和其他肝硬化并发症的发病机制中发挥关键作用。肝硬化患者十二指肠活检显示紧密连接蛋白表达降低。失代偿期肝硬化患者的紧密连接蛋白表达低于代偿期肝硬化患者。Assimakopoulos等人在“肝硬化患者肠紧密连接蛋白表达改变：肠通透性增高的发病机制”中报告了他们探讨肝硬化患者肠粘膜中调节肠旁细胞通透性的紧密连接蛋白（TJ）的表达和其与肝病分期和系统性内毒素血症发生的潜在关系的研究结果。对24例肝硬化失代偿期（n=12，a组）或代偿期（n=12，B组）患者和12例健康对照者接受十二指肠活检。免疫组化检测肠上皮中TJ蛋白occludin和claudin-1的表达。同时测定血浆内毒素浓度。肝硬化患者血清内毒素水平明显高于正常对照组，而失代偿期患者血清内毒素水平明显高于代偿期肝硬化组。失代偿期和代偿期肝硬化患者occludin和claudin-1的表达均显著低于对照组。与代偿期相比，失代偿期患者的上述改变更为明显。关于闭塞素，在肝硬化患者中，肠上皮中观察到一种特殊的表达模式，从隐窝到绒毛顶端的表达逐渐增加。Occludin和claudin-1表达与Child-Pugh评分、食管静脉曲张程度和内毒素浓度呈负相关。他们的研究首次证实了人肝硬化可引起肠上皮细胞紧密连接的显著改变。这些变化可能是肝硬化患者肠屏障功能障碍和高通透性的重要细胞机制。

另一项研究表明，代偿性肝硬化患者的胃十二指肠和小肠粘膜中紧密连接蛋白表达没有改变，但结肠中这些蛋白表达下调。Pijls等人发表在《美国生理学杂志》的“代偿性肝硬化患者大肠通透性增加”研究报告也报道，肠屏障功能障碍，促进细菌和细菌产物的转运，在肝硬化及其并发症的病理生理过程中起着重要作用。肝硬化患者的肠道通透性增加。由于代偿性肝硬化患者的小肠和大肠通透性及紧密连接的数据很少。他们采用多糖试验对26例代偿性肝硬化患者和27例对照组的肠道通透性进行了评估，研究稳定代偿性肝硬化患者与健康对照组的小肠和大肠通透性，并在十二指肠和乙状结肠水平评估粘膜活检中紧密连接蛋白的表达。代偿性肝硬化患者和对照组的0-5小时尿蔗糖排泄中位数和乳果糖/鼠李糖比率具有可比性，而这些患者的5-24小时尿三氯蔗糖/赤藓糖醇比率增加。十二指肠活检组织中claudin-3基因转录下调，乙状结肠活检组织中claudin-4基因转录下调，在蛋白质水平上，十二指肠和乙状结肠活检组织中ocludin的表达均显著增加。这项研究表明，稳定代偿性肝硬化患者的胃十二指肠和小肠通透性没有改变，而大肠通透性增加。小肠和大肠中紧密连接蛋白的表达只有有限的改变，还需要进行功能分析来确定肠道通透性。