怎样站在巨人肩膀上

本博文以crispr-cas9为例，探讨怎样站在巨人肩膀上进行高水平的科学研究。

一. 科学发现（crispr-cas9的发现）

1. 1987年Ishino等在研究大肠杆菌iap基因序列时，发现一段独特结构（原始科学发现，但无命名，无功能，无普遍性研究，无深入研究）。

2.1993年Mojica在嗜盐古细菌的基因组中发现了30-34 bp的回文重复序列，这些序列由35-39bp的间隔序列隔开（独立科学发现，之后进行一系列深入研究）。 到2000年，Mojica已经在二十种不同的微生物基因中发现了这种特殊的串联重复序列（普遍性研究）。2002 年，Jansen命名其为CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat, 成簇规律性间隔短回文重复）（科学概念）。

3.Jansen 和 Mojica发现许多基因与crispr存在关联，其编码蛋白为核酸酶和解旋酶，这些关联蛋白（CAS， CRISPR-associated proteins）与CRISPR组成了一个功能体，从而发现了一个全新的CRISPR-Cas系统（发现）。

二．机制研究（CRISPR-Cas系统免疫防御机理的揭示）

1.2005年Mojica小组经生物信息学序列比对，发现CRISPR间隔序列与病毒或质粒等外源核酸具有同源性（发现）。  

2.Makarova 等据此提出假说：crispr可能提供对抗外来核酸适应性免疫（假说）。 

3.2007年Barrangou等根据上述假说进行实验：插入或者删除几个与噬菌体序列互补的CRISPR间隔序列，结果改变了嗜热链球菌对噬菌体的免疫力，证实CRISPR / Cas 是细菌抵抗外来噬菌体攻击的免疫系统（实验）。 

4.crispr-cas9作用机理：病毒攻击细菌，如果细菌存活，会把病毒留下的 DNA 片段添加到自己的 CRISPR中 成为一段 spacer。当再次遭受病毒攻击时，细菌的 CRISPR / Cas 便会检测病毒的 DNA 序列，表明该病毒曾经来犯过，Cas 将会酶解该病毒的 DNA，使其失去攻击能力。

三. Crispr机理深入研究

1. 2009年,Hale发现crRNAs特异性的引导cas 酶降解外源核酸（发现）。

2. Mojica通过分析噬菌体原始空格毗邻序列发现了一个保守序列命名为原始间隔相邻基序 ( proto-spacer adjacent motifs，PAMs)（发现）.Semenova发现即使CRISPR spacer匹配正常，只要CRISPR motif突变就会造成噬菌体抗性。由此推测PAME在spacers选择上也起着关键作用（发现）。 

3.2011年，Elitza等发现化脓性链球菌CRISPR位点包括四部分: Cas9 , crRNAs, tracrRNA 和pre-crRNA。tracrRNA与CRISPR-Cas9相关，它与Cas9蛋白共同作用生成 crRNA（发现）。

4.2011年Charpentier 和Vogel在化脓链球菌发现tracrRNA，其序列与crRNA反向配对。cas9、RNase III 与tracrRNA共同负责crRNA的加工成熟（发现）。

5.2011年Siksnys将嗜热链球菌的CRISPR/Cas能够转移到大肠杆菌中，可以对抗外源质粒的转移和噬菌体感染，同时证实了Cas9是唯一必须的cas蛋白(实验）。至此，CRISPR-Cas系统免疫防御机理得以完全的揭示。

6.2012年Jinek等发现了II 型CRISPR切割双链DNA的分子机制，成熟crRNA通过碱基配对与tracr-RNA形成一个双RNA，引导Cas9切割特定位点的双链DNA。这是一发现，为下一步应用奠定了基础。

7.crispr-cas9免疫性防御机理：当细菌和古细菌遇到病毒或者质粒侵袭之时，它们酶切这些外源核酸成为很小序列，并将其中的一部分整合到自己的CRISPR位点。当该病毒或质粒再次入侵时，会诱导CRISPR转录生成CRISPR RNAs (crRNAs)。crRNA根据序列互补原则引导Cas9到达特定DNA位点，Cas9行使剪切功能。

三．应用研究（sgRNA-cas9基因编辑工具的发明）

1. II 型CRISPR切割双链DNA的分子机制是成熟crRNA通过碱基配对与tracr-RNA形成一个双RNA，引导Cas9切割特定位点的双链DNA。根据这一分子机制，Jinek等尝试将crRNA 和 tracrRNA 黏接在一起，形成了一个新的单股嵌合体RNA sgRNA。实验证实sgRNA与Cas9结合仍然能够切割双链DNA。sgRNA-cas9具有搜索和切割DNA的双重功能，借此可以轻松的编辑DNA。至此，他们发明了著名的crispr-cas9技术。

2.这一技术非常简单：只需合成一条sgRNA，连同Cas9就可以编辑DNA。和从前的TALEN等 基因组编辑方法不同，cas9是一个通用酶，只需要合成一个gRNA引导Cas9就可以进行DNA定点编辑，而合成一条RNA是非常容易的。基因组编辑因此变得简单、便宜，也更加有效。

3.2013年华裔生物学家Feng Zhang等设计了II 型CRISPR/Cas系统：SpCas9, SpRNase III, tracrRNA和pre-crRNA进行DNA编辑实验，结果显示只需SpCas9, tracrRNA和pre-crRNA就可以对人和小鼠的细胞进行精确DNA编辑，而SpRNase III并不是必须的。通过人工构建的方法，把tracrRNA和pre-crRNA结合成一条单一的短RNA，与质粒连接起来更加简单方便。通过设计短pre-crRNA 5’端的序列与基因组中特定位置的序列互补，就可以特异性地编辑不同位点的基因。把多个引导序列编码成一个单一的CRISPR阵列，一次可以编辑哺乳动物基因组内的多个基因。Cas蛋白没有特异性，只需合成一条sgRNA就能实现对DNA特定靶点的编辑。sgRNA的序列只有80bp左右的碱基，因此合成更简单方便。Zhang等的研究首次实现了CRISPR系统对哺乳动物细胞的DNA编辑，证实了CRISPR/Cas系统能够编辑真核细胞，也表明了它有改善疾病动物模型和治疗疾病的潜力。

4.2013年同一期science也发表了Church的研究，他们做出了与张峰类似的实验。2013年2月，Doudna也发表了她们小组的同类实验结果。

  cispr-cas9的基因编辑工具是一系列科学发现、科学假说、科学实验的结果，是后来者站在前人肩膀上进行科学研究的结果。探索这个成功之道，有助于启发我们如何站在前人肩膀上进行高水平的科学研究。

Huang M . Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia.[J]. Blood, 1988, 72.

Induction of differentiation may be an alternative approach to the treatment of APL. Retinoic acid (RA), an analog of vitamin A, is one of the many agents which can induce differentiation and terminal cell division of leukemic cells in vitro [5]. At the present time, several cases of APL treated with 13-cis RA have been reported with encouraging results [6-9]. In this paper, we report the in vitro studies and therapeutic trials of 24 APL patients using all-trans RA. 

5. Koeffler HP: Induction of differentiation of human acute myelogenous leukemia cells: Therapeutic implications. Blood 62:709, 1983  

6. Flynn P. Miller W, Weisdorf D, Arthur D, Banning R, Branda R: Retinoic acid treatment of acute promyelocytic leukemia: In vitro and in vivo observations. Blood 62:121 1, 1983  

7. Nilsson B: Probable in vivo induction of differentiation by retinoic acid of promyelocytes in acute promyelocytic leukemia. Bri Haematol 57:365, 1984 

 8. Daenen 5, Vellenga E, van Dobbenbugh OA, Halie MR: Retinoic acid as antileukemic therapy in a patient with acute promyelocytic leukemia and Aspergillus pneumonia. Blood 67:559, I 986 

 9. Fontana iA, Roger iS, Durham iP: The role of 13-cis retinoic acid in the remission induction of a patient with acute promyelocytic leukemia. Cancer 57:209, 1986

  国外使用顺式维甲酸，而王振义教授使用的是全反式维甲酸。后来证实顺式维甲酸使用范围很狭窄，而全反式维甲酸使用范围较广。