活细胞成像：更深、更快、更宽
2019-03-05 21:13
在短短20小时内，斑马鱼胚胎就从一个单细胞发育成一个拥有2万个细胞能够扭动尾巴的生物体。自从Philipp Keller在2005年开始读博士时，他就想看看在如此之短的时间内这一复杂的过程是怎样实现的。由于胚胎细胞以每秒几微米的速度移动，他需要高速视频来捕捉这一过程。
Keller说，激光片层扫描显微镜是解决这个问题的必要手段。他现在是位于弗吉尼亚州阿什伯恩附近的Janelia 科研园区的一名生物学和物理学专家。即使内部光学系统并非完全如此，激光片层扫描显微镜的概念其实很简单，即一次照亮样品的某个平面，拍摄宽场图像，然后移动平面。这种方法比典型的共聚焦显微镜逐点扫描快得多。与其他技术相比，它对单个细胞造成的光毒性更小。因此，对于很多对高速细胞活动(如神经元的放电或血细胞的流动)感兴趣的科研人员来说，激光片层扫描系统已经带来活细胞成像的下一波浪潮。其他推动活细胞成像发展的技术还包括多光子显微镜和以拉曼显微镜和三倍频成像为代表的无标记成像方式。
“活细胞成像一直都是显微镜的终极用途。”位于德国耶拿的蔡司显微镜公司的应用技术专员Christian Hellriegel这样说。他继续解释，活细胞成像超越了生命的结构，而观察生命的过程，包括细胞或分子如何移动，细胞如何对环境或邻居作出反应，以及大脑如何运作或损伤如何愈合。
公司和科研人员们正在开发一系列的工具，所有这些选择可以归结为以下三种，纽约州伊萨卡的康奈尔大学的应用物理学专家Chris Xu说。“每个人都想看得更深、更快、更宽。”
更深：多光子成像
为了在显微镜下看得更深，一个解决方案是多光子成像，位于英国剑桥的徕卡微系统公司的首席科学官Julian Burke说。徕卡刚刚推出了SP8 DIVE显微镜，这是一个多色双光子系统，可以深入观察活体组织。诀窍是，它不再是用一个光子，而是用两个长波长光子来激发荧光团。Burke说，在最理想的条件下，这些更红、更长的光波可以穿透深达500微米的组织，因为它们不太容易被组织本身散射。它们的光毒性也更低，而且不容易令荧光团淬灭，他补充说。
法国勃艮第大学的化学专家David Monchaud因为多光子成像的精度、灵敏度和活细胞成像能力而被吸引。他研究DNA和RNA四联体，这两种核酸结构最初是通过共聚焦显微镜在固定的死细胞中观察到的。利用多光子显微镜，他可以确认活细胞中存在四联体，这表明它们可能在那里发挥某种功能。“这种显微镜是无价的，” Monchaud说。
如果两个光子很好，那三个光子会不会更好呢？这是Xu正在研究的问题。通过利用三个波长很长的光子来激活一个荧光团，他可以更深入地观察活体样本。在2017年，他报道了对1毫米深处老鼠神经元放电的可视化。Xu说，这种显微镜可以直接通过密集的光散射白质成像，这是以前的显微镜无法做到的。他说，一些实验室正在利用这项技术研究细胞迁移和神经科学等课题。
更快：激光片层扫描技术
然而，多光子成像仍然依赖于速度较慢的逐点扫描。Xu说：“速度和深度总是需要平衡的。” Keller想要在60~90秒内扫描整个斑马鱼胚胎，所以激光片层扫描显微镜就成为了问题的解决方案。
尽管激光片层扫描显微镜是一个古老的概念，蔡司显微镜公司的研究人员在1903年就首次提出了这个概念。但直到这个世纪，这些用于处理图像体积的荧光标签才开始汇聚在一起，使激光片层扫描技术成为主流。蔡司Z.1型激光片层扫描显微镜包括一个悬挂在物镜前的培养槽，里面可以容纳整个生物体（例如一只果蝇甚至是一只小章鱼），而且可以方便地旋转以获得更好的视角。
Keller在2008年发明了一种被称为数字扫描激光片层荧光显微镜（DSLM）的系统，使他得到了梦寐以求的速度：每分钟15亿体素。这个系统的设计不同于常规的商业化显微镜。Kelle将激光和物镜以正确的角度放在台子上；然后，他将斑马鱼胚胎植入琼脂糖中，并将琼脂糖置于光源和物镜之间的试管中。他通过在激光片层中前后移动样品，从而扫描所有平面。他观察到了以前从未见过的斑马鱼胚胎发育和胚层形成的实例。
从那时起，Keller革新了这项技术。另一个问题是，如果样品很大或不透明，激光片层可能无法穿透它。为了解决这个问题，Keller开发了SiMView。他将激光片层和相机加倍，在20毫秒或更短的时间内，即可收集4张图像，因为每个相机可以快速连续地聚焦在两张图像上。
他解决的另一个问题是各向异性，即一个目标在横向xy方向的分辨率通常比在轴向z方向的分辨率高。为了获得在任意视角下具有相同分辨率的3D图像，keller将相机和激光片层的数量再次翻倍至4个，并将这些图像进行数字组合，形成一种名为isoview的技术。
在马里兰州巴尔的摩的国家生物医学成像和生物工程研究所，显微镜专家Hari Shroff也对神经发育科学感兴趣。他与来自康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学和纽约的斯隆—凯特琳研究所的科研人员合作，正在对线虫大脑的发育过程进行成像。
“这些蠕虫胚胎很难成像，而且对光线非常敏感，”Shroff说。“你真的必须要快。”
他和他的同事们想要避免经典的激光片层操作。在那种操作中，样品被嵌入一管琼脂糖，并被激光和照相机包围。相反，他们更喜欢把蠕虫胚胎放在标准的盖玻片上。
为了保证入射的激光片层和物镜之间的角度刚好合适，Shroff的解决方案是从垂直方向各倾斜45度。这个设备看起来很像一个标准显微镜，除了载物台上那两个倾斜的物镜。样品保持静止，来自两个不同物镜的激光片层连续移动。该系统被称为反向选择平面照明显微镜（iSPIM）。
和Keller一样，Shroff也处理了各向异性的问题，但是他不是通过增加更多的物镜。他只是简单地将它们分别设置为生成一个激光片层或收集一个图像，并在两者之间交替。首先，物镜A生成激光片层，物镜B获取图像，然后互换任务。研究人员称这种布局为对称双视图iSPIM（diSPIM）。
但是Shroff和他的同事们并没有就此结束。还有另一个版本的仪器被他们称之为三视图SPIM，他们在盖玻片下面增加了一个额外的物镜，以收集额外的输出并提高空间分辨率，而不需要增加速度和激光强度。最后，研究人员通过在一个镜像位置的盖玻片进行了diSPIM实验。这就在目镜之外创建了一个“虚拟图像”，就好像样品和激光片层都加倍了。通过正确的算法，Shroff和他的团队可以从这些反射中获取信息。其结果是在速度加倍的条件下进行更加灵敏的成像，这一切都只是因为加入了一块镀铝的盖玻片。
更宽：鲜活生动的风景
纽约哥伦比亚大学的生物医学工程师Elizabeth Hillman开发了一种激光片层技术，这种技术只需要一个物镜就能产生激光片层，并从样本中收集所有信号。其样本可以是一个完整的、自由移动的生物体。该系统使用一面镜子收集样品中的光和相机焦点。她将她的系统称为“扫描同轴平面激发”（SCAPE）显微镜。
与其他新的激光片层扫描技术一样，SCAPE具有速度快的优点。Hillman利用新型相机每秒可以对样本成像100多帧。这使得她能够对清醒的、移动的生物的细胞进行成像，比如爬行的果蝇幼虫的闪烁神经元，或者抽搐的斑马鱼的跳动的心脏，而不会在动物移动时造成影像模糊。“我们的速度如此之快，以至于我们可以看到前所未见的时间信息。”
Hillman说，SCAPE物镜很容易适配各种类型的样品。这些细胞或生物体可能在培养皿中，甚至在老鼠的大脑里都没关系。
哥伦比亚已经将SCAPE技术授权给徕卡，虽然Burke还不确定徕卡的SCAPE系统将在何时面世。徕卡还获得了另一种扫片技术斜平面显微镜（OPM）的授权。这是由伦敦帝国理工学院生物医学光学专家Chris Dunsby开发的。
Dunsby的目标是在保持良好分辨率的同时，进行单物镜的激光片层显微镜实验。他的技术使用三个显微镜连续放大样品，从倾斜的平面捕捉光，并扫描激光片层。
Dunsby说，整个装置提供了高速、亚细胞分辨率的3D成像。例如，他将其与钙追踪染料一起使用，在大鼠心肌细胞中观察可能在心力衰竭时触发致命型心律失常的钙离子浓度风暴。“我们第一次能够在三维图像中看到，钙离子波从心肌细胞中产生的具体位置。”他解释说。
OPM也适用于多孔板。Dunsby和他的同事曾用OPM和一个荧光生物传感器来测量多细胞肾脏模型中葡萄糖的摄取情况。对42个孔里的样品成像只花了9分钟。
接下来呢？
SCAPE和OPM技术非常互补，Burke说,徕卡计划在即将发布产品上将它们合二为一。
活细胞成像的下一步是什么？Hellriegel说：“我觉得我们还没有发掘出激光片层扫描技术的全部威力。”例如，他认为可以将超高分辨显微技术整合到这一技术之中。
Burke预测，更多能够标志细胞事件(如神经传递)的荧光蛋白和染料将使实时、快速成像对研究人员们具有巨大的吸引力。他还预计，为了进行快速成像，速度更快、灵敏度更高的相机将成为必须研发的组件。
要不要荧光标签？
有时候，研究人员不愿使用荧光标签。首先，将它们引入样品就很麻烦。也很难确定荧光团是否准确地反映目标蛋白质的位置和活动。标签可能无法有效地标记蛋白质，也可能随着时间的推移被淬灭。
纽约城市大学亨特学院的生物物理学专家Hyungsik Lim使用三倍频（THG）显微镜来对髓鞘（神经线周围包裹的绝缘层）进行成像。这项工作是在活细胞和组织中进行的，而且不用任何荧光标签。当三个入射光子能量结合到一个发射的光子中时，就会产生三倍频（THG）信号。这项技术对组织边界的折射率变化特别敏感。比如髓鞘这样，处于水溶液和富含脂质或蛋白质之间的结构。
另一个选择是拉曼显微镜，即拉曼光谱仪的扫描版。日本大阪大学的应用技术专家Katsumasa Fujita正致力于将这一技术推广到显微镜领域。拉曼光谱依赖单一波长的入射光激发样品中的不同分子。组成这束光的光子无论被样品中的分子反弹还是折射，他们大部分会保持入射时的波长。但是通常每一亿个光子中会有一个在反弹之后发生光谱红移，即变得能量较低，频率向红光区靠近。光谱红移的程度取决于令光子发生散射的分子。拉曼光谱仪就是以这种方式鉴定样品中的组分。
在生物显微镜上，拉曼散射的工作原理也是相似的，它能描述一个样品中各分子成分的分布，无论是核酸、蛋白质还是脂肪。但是，除此之外它无法进行更深入的鉴别，例如它无法对不同的激酶进行鉴别。
与此同时，纽约哥伦比亚大学的研究人员正努力将多种荧光标签加入拉曼成像的细胞样品中。生物物理化学专家Wei Min指出，传统荧光成像中最多可以同时使用大约五种荧光标签，因为荧光团的发射光波长范围较宽，容易彼此重叠。但在拉曼光谱中，发射光的波长范围会变得更窄，因此应该可以使用更多的荧光标签而不发生重叠。
Min过去的博士后Lu Wei，现在是帕萨迪纳市加州理工学院的化学教授。她选择接受这一挑战。她和她的同事们设计了24种不同的荧光染料。通过变换分子中的碳碳三键、碳氮三键，以及同位素成分，他们创造出了不同的荧光基团。
现在Wei和Min仍然在努力开发更多的荧光染料，以及利用这些荧光染料对目标生物分子或者细胞器进行特异性标记的方法。Min认为也许至少50种标签才够用。■
（译者李楠是中国科学院深圳先进技术研究院副研究员。）
作者Amber Dance 是加利福尼亚州洛杉矶的自由撰稿人。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2018年3月27日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2018/03/live-cell-imaging-deeper-faster-wider。
《科学新闻》 (科学新闻2019年2月刊 科学·生命)
