寻找合适的抗体：抗体验证中的挑战和应对
2018-08-01 15:22
在过去的几年里，分子生物学家们认识到一个令人惊恐的事实：他们在实验中需要用到的一些关键性的试剂竟然效果不稳定，以致于他们之前所做的大量工作的结果可能是错误的。出现这个问题的主要原因在于抗体，这是研究人员从定量受体表达到纯化关键基因产物一直都在使用的一类蛋白质。
在过去，科研人员如果需要某个蛋白质的抗体，他们要么自己制备，要么从同事那里获得。虽然这很简单，但过程却乏味无聊，并且很花时间。随着基因组学和蛋白质组学的兴起，这种手工方法再也无法给研究人员提供其所需的大量抗体。有需要就有市场，抗体生产行业应运而生，以满足日益增长的需求。然而事与愿违，低准入门槛和巨大利润的诱惑使得大量可疑的试剂很快就占领了市场。现在，研究人员正在试图找出问题原因并尽力改善现状。
在加州圣地亚哥的One World Lab是一家主要致力于简化抗体验证过程的抗体经销公司，他们的总裁兼首席执行官Mike Simson说：“我认为这是一个日益严重的问题，因为它无处不在，每年都有数亿美元的浪费。在这一点上，市场上的可疑试剂现在已经有失控的趋势了。”
轻链，重链和供应链
大多数科研人员不知道的是，很多供研究使用的抗体会沿着迷宫般的供应链进入实验室。少数供应商在自己的工厂里制造抗体，但多数知名供应商的运作方式则像百货公司。如同中国深圳的大量工厂生产着世界上大部分的电子设备一样，中国武汉也有众多生产抗体的企业。供应商购买这些产品，然后把自己的品牌和股票号码放在上面做贴牌销售。因此，看似是市场上有诸多品牌进行竞争，为消费者提供了多种产品选择，但是实际上销售的却是一个比消费者看到的要小得多的产品集合。
研究人员经常是从某个供应商购买了一种抗体，发现这种抗体并不适用于他们的研究，然后就换一下供应商订购另一种抗体产品，但是他们完全没有想到它们本质上是同一种产品。购买一种产品需要花费数百美元，研究人员通常会在这些重复的购买行为中浪费数千美元。更糟糕的是，当一种抗体在发表文章时表现得足够好时，下一批抗体可能会令人失望，研究人员也无法追踪问题。“如果你的结果没有可追溯性，你就没有问责机制，那么你就没有重现性。没有重现性，就没法谈科学了，” Simson说。
为了解决这个问题，One World Lab提供了来自大约40家不同制造商的完全可溯源的抗体产品，并以样品大小的试剂盒出售。研究人员可以针对特定的目标订购一组真正不同的抗体，然后对它们进行测试并找出最适合它们的抗体。Simson称这种做法对抗体制造商和研究人员都有好处，他说：“需要有这么一个地方，数据可以得到反馈，以便公司都能了解他们的产品效果如何。”
不幸的是，虽然研究人员似乎很珍视One World Lab的服务，但他们并不想为此买单。Simson说：“我们在实践中发现，研究人员购买抗体样品试剂盒，对其进行测试，并确定哪些试剂有效，然后就直接向制造商去购买了。他们应该通过One World Lab来购买，以保持这个平台可以生存。”令人遗憾的是，Simson的担忧并非无的放矢，该公司最近宣布将关闭这项服务。Simson在公司网站上发布的一则公告中强调，尽管One World Lab的商业模式需要调整，但“产品的透明度和性价比对推动科学发展十分重要”。目前还不知道将来是否会有其他公司能够更好地提供这一服务。
阳性选择和阴性选择
除了呼吁供应链更加透明之外，该领域的许多专家还主张建立一套更正式的、全行业通用的标准来检验这些试剂的质量。人类蛋白质图谱项目的负责人、瑞典斯德哥尔摩KTH Royal Institute of Technology生命科学实验室的教授和创始人Mathias Uhlén说：“显然，我们需要清晰的列出一些对研究人员来说更有用的试剂。”
Uhlén和他的同事在开发人类蛋白质图谱时需要考虑抗体验证的问题，该图谱制备了数以千计的抗体来检测蛋白质在整个人体组织中的表达模式。Uhlén还倡议组建了抗体验证国际工作组（IWGAV），该工作组去年10月发布了拟定的指南。大约在同一时间，世界生物学标准研究所（GBSI）在加利福尼亚州太平洋格罗夫的斯洛玛尔会议场举办了一次会议，并成立了工作组继续讨论这个问题。
IWGAV和GBSI制定的所有新标准都有两个基本原则。Uhlén说：“抗体必须针对特定的应用方式进行验证。”例如，一种抗体适用于对凝胶中变性的蛋白质进行分子印迹，无法作为证据推断在非变性检测中（比如荧光激活细胞分选）它同样有效。其次，新标准要建立实验流程或者叫框架方案，用来规范一个抗体必须通过哪些测试才能确定可以进行某种特定应用。
每个框架方案使用不同的技术和方法来对抗体的有效性进行验证。例如，研究人员可以采用一种遗传学方法，敲除或降低抗体假定目标的基因表达，并检验这是否消除了抗体的结合位点。另一种方法是利用待测试的抗体纯化目标蛋白，然后通过质谱法确定蛋白的同一性。
尽管这些抗体验证标准的建立大体上都遵循了相似的原则，但仍存在一些争议。其中一个争论的焦点是验证结果是应该划定一条及格线，还是应该给出一个榜单以便在相同的目标和应用中获得不同抗体的评分来判断它们彼此的相对效果。Uhlén倾向于前者，而GBSI则倾向于后者。
要让科研人员就这些标准达成一致已经很困难，应用它们就更难了。Uhlén的团队一直在系统地测试用于人类蛋白图谱的所有抗体，看看它们是否符合新标准。Uhlén说：“我们的目标是三到四年，也许五年后，我们将只有那些已经被正式验证过的，至少通过蛋白质图谱中有一个框架方案测试的抗体；但这已经需要大量的投入，我们正为此而努力。”
对于绝大多数尚未在新定义的标准下得到验证的商业化抗体，最终用户可能需要自行处理。在尚未具备基因敲除或质谱功能的实验室中，一种新的RNA原位杂交方法可能会对研究人员有所帮助。
RNA杂交传统上是一项棘手的技术，但是一家总部位于加州纽瓦克的生物技术公司Advanced Cell Diagnostics（ACD）希望改变这一现状。该公司的RNAScope系统使用特定的探针和标记物来快速、稳定地量化细胞或样本中的RNA水平。虽然RNA的转录不能完全反映蛋白质的表达，但研究者可以利用相关性作为检验抗体的一种简单方法。ACD市场副总裁Chris Silva表示：“RNAScope确实是一种验证蛋白质表达的正交方法，它允许使用者将RNA转录量作为以后翻译成的蛋白质的前体来进行验证。”目标蛋白的抗体结合水平若明显不同于其RNA水平，将为抗体的质量问题提供早期预警。
研究人员还可以使用RNA分析技术来缩小靶蛋白的范围，然后再根据需要来订购相对昂贵的抗体。Silva表示他的公司可以在几周内为任何序列提供定制的RNAScope探针，来加速筛选值得进行抗体研究的目标蛋白。
保持命中率
尽管一些评论人士将目前的形势描述为一场危机，但业内资深人士认为，这是一个由来已久的问题，只是终于引起了人们的注意。位于英国剑桥的Abcam公司新产品开发副总裁Alejandra Solache表示她不认为这是一个新的问题。她解释说：“我们用于抗体验证的新工具实际上让我们更清醒地认识到我们常用工具存在一些潜在缺陷，比如我们过去一直在使用的某些抗体。”
由于研究人员对抗体验证并不太重视，所以制造商对这个领域的兴趣也不是很大。“研发抗体的大部分成本来自于验证；这可能是一些公司一直在努力降低成本而不太重视的地方，”Solache说。
Abcam的目标是为抗体的生产和检测制定高标准。Solache补充说提供高质量的产品是他们公司的责任；随着可以用于抗体验证的新技术的逐渐兴起，他们正在尝试在更大的范围内使用这些技术，这样他们就能更好地评估这些产品。同时，Solache也表示他们公司已经利用Uhlén和他的同事们所倡导的技术验证了许多抗体。
Abcam是市场上重要的“杂合型”抗体供应商之一，他们的主营业务包括销售他们自己研发的抗体和其他公司贴牌生产的抗体。Solache坚称他们会仔细选择供应商，并补充解释要求供应链完全透明是有问题的——供应商通常会与制造商签订合同，禁止公开这种关系。她说：“我认为，如果抗体的质量很好，这种不透明就不一定是问题。我们需要先解决质量问题。”
对于那些只关心在哪里能买到好抗体的研究人员来说，Solache给出的建议是寻找提供验证数据的公司。无论是在公司网站或者独立的评论页面上，对于特定抗体的评价，都可以为抗体的选择提供很好的参考。
像Abcam这样的大供应商在投资新的抗体验证技术时，小公司也会担忧自己的问题，特别是那些专门从事抗体生产的公司。这些公司必须首先决定选用哪些抗原来开发抗体，并试着猜测它们的需求量有多大。伊利诺伊州罗斯蒙特市Proteintech公司的首席执行官Jason Li说：“科学本身的定义决定了有人要从事前沿的研究工作。”这家公司专注于抗体，ELISA和蛋白质。Li补充说：“科研人员需要一些抗体试剂来进行他们自己的前沿研究，而这样的试剂以前从来没有人用过。对于制造商来说，这其实是一件非常困难的事情，因为没有人能够预测科学的发展。”
这个难题使得抗体制造业在某些方面与电影和音乐行业相似。抗体制造商推测哪些抗原可能成为受欢迎的目标，进而投资进行其对应抗体的开发，并进行验证，然后看销售情况。Li估计大约有一成被选中的抗体会脱颖而出，其他九成的抗体则会被打入冷宫。人们希望，这十分之一的命中结果带来的利润能够为未来十种抗体的开发提供资金，并使周期持续下去。
近年来，多种因素的影响导致这种营销模式发生了动摇。Li说，抗体供应商一直靠从制造商的利润中分成，而导致先前为了快速回报而向抗体制造商投资的金主现在选择撤资。随着预算缩减，很容易发现哪里削减支出比较容易。“总投入中三分之二的钱是用来验证抗体，而制作一个抗体的花费只有三分之一，”Li说。不透明的供应链加剧了这个问题，使研究人员无法确定劣质抗体的来源。
“解决这个问题的唯一方法就是增加透明度，”Li表示，他还提出了一个设想，在未来，“每个抗体的生产流程都能够向研究人员进行全方位开放，包括原产地，制作工艺流程，适用领域和局限性等。”
源头上的改变
当抗体制造商和供应商在透明度和标准上苦苦挣扎时，研究人员也在尝试另辟蹊径。位于马萨诸塞州丹佛市的科研和诊断试剂公司Cell Signaling Technology 的首席科学官Roberto Polakiewicz说：“抗体有好有坏；有知道如何使用它们的人，也有不知道如何正确使用它们的人。”
Polakiewicz解释说，许多有经验的研究人员已经发现如何通过寻找数据来搜索商业化抗体的有效性信息。可信度较高的抗体供应商现在通常会向科研人员提供数据，来介绍他们目录中的每一种抗体是如何被验证的。有自主测试能力的实验室也可以自行检验他们所订购的抗体。在实验中计划使用的特定实验流程也是采购中应该考虑的因素。“例如，当你使用免疫荧光法时，如果你使用的是错误的固定方法或固定剂，即使是使用了很好的抗体，也可能会得到错误的结果，”他说。
即使在实验结果被发表了以后，也不能忽视对抗体使用细节的记录。“如果你想重复一篇论文中的结果，清楚所有方法的来龙去脉是尤为重要的，”Polakiewicz说。但是他也补充道，研究人员在这方面的记录是参差不齐的。没有报告抗体来源和货号的论文其实很难重复。
批号也非常重要，但是往往会被忽略；作为一种生物产品，抗体的效果很容易随批次而变化。好的供应商往往津津乐道于宣传他们的质量控制程序。但为了获得最大的可靠性，研究人员应该尝试用同一批次的抗体进行一系列的实验。
对于抗体供应商和研究人员来说，最终解决抗体验证问题的方法将是依靠科学研究的基本原理。“说到底，这更多的是要以扎实的研究为基础，开发一种抗体并对其进行验证，就像要做好一个实验一样，需要正确的实验操作和合理的实验设计，”Polakiewicz强调道。■
（译者李楠是中国科学院深圳先进技术研究院副研究员。）
本文作者Alan Dove是马萨诸塞州的一位科学作家和编辑。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700116
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2017年9月14日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/features/2017/09/agreeable-antibodies-antibody-validation-challenges-and-solutions。
《科学新闻》 (科学新闻2018年7月刊 科学·生命)
