今天就来根据咱自个的经验和阅读的文献聊一聊基础篇：克隆方法的进阶。

首先聊聊最低级的TA克隆，为啥最低级呢？因为TA连接克隆无法保证插入的方向，而且还需要末端加A，虽然taq酶自带加A属性，但是taq酶的保真性低啊，没人想自个的克隆有碱基突变吧？所以TA连接貌似都快要绝迹了，除了之前说过的二代测序建库过程中adapter的连接还在用这种连接方式。具体如图：

图片来源：TA cloning - Wikipedia

接下来就是内切酶连接了，这样用两个酶切位点可以做到方向唯一确定，但还是有一定的缺点，除了待克隆的基因内部不能有内切酶的识别位点外，还会有scar遗留（对于融合基因就是各种麻烦）。还有一个比较进步的方法就是golden gate连接法（利用某些内切酶识别位点和切割位点不一致的特性），好处就是可以一次连接多个片段，实现条件性无缝连接，感兴趣的可以自行科普一番。内切酶克隆原理具体如图：

图片来源：Khan Academy

然后嘛就是稍微高级一点的SLIC了，具体过程就是用PCR给带克隆片段两端加上一段骨架上的同源臂片段，将插入片段和线性化载体骨架同时用外切酶处理使得两端同源臂部分成为单链，这样序列互补的单链就可以相互互补配对，通过重组或者像内切酶连接的方式一样完成无缝连接！这个方法显著地进步就是可以实现无缝连接！虽然也可以实现多个片段无缝连接，但是这种方法也有一个小小的缺点，就是连接大片段的效果不是特别好。具体如图：

图片来源：Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC

随后就是牛逼的gibson assembly了，其在SLIC的基础上引进了DNA聚合酶和taq连接酶在体外就可以完成重组DNA的修复和连接，不仅连接效率大幅提升，而且还可以实现大到上百kb的大片段连接，还记得2010年Venter的人造生命的大新闻吗？就是用gibson assembly干的。具体如图：

图片来源：Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases

最后嘛，就推一下前几天介绍的PEXER和CATCH。可以在大肠杆菌内实现上百kb级别的大片段置换，简直smart！具体如图：

图片来源：Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding

更多精彩内容请关注微信公众号：生物技术的行星