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维生素C到底是不是一个信号分子---回顾我的首创(颠覆)性论文发表历程

已有 4036 次阅读 2021-2-15 12:41 |系统分类:科研笔记

高能预警:第一次写这么长的文字,如有不适请见谅


        2021126日,早上打开电脑就看到了我们关于维生素C新功能的文章在线发表的信息。望着屏幕上文章的全文网页,我首先得感谢Int J Biol Macromol.愿意发表我们的论文,以使得凝聚无数努力和汗水的发现有机会呈现在学界面前。但是就在我的心情如释重负般放松下来的时候,忽一下又被一种空寥寥的感觉所充满。松弛下来是因为文章终于发表,学生也可以有资格毕业了;空寥寥的感觉是因为十年投入无数心血和精力的结果并没有得到预期的学界认可。思考再三,我还是决定写下这篇文字,一是慰藉一下多年的心血和满鬓的白发,另一个是鼓励一下学生,不要因为目前的挫折而丧失做原创的勇气和信心。最重要的是我想通过这篇文字让更多的人关注我们的这个发现,可能对不同领域应用Vc的各位同行具有一定的启发,结果如何还是让学界去判断、验证和补充吧。

 

      众所周知,维生素C又名抗坏血酸(Ascorbic Acid)是人类必需维生素。除了灵长类和果蝠等少数物种外,大多数动物都能够在肝脏中合成Vc。目前国际上对Vc的认识大多聚焦于Vc分子的化学还原性,比如清除活性氧的抗氧化活性,以及作为一些双加氧酶的辅因子,还原酶活性中心因催化过程产生的Fe3+为Fe2+,以再生酶活性。对于Vc是否是一个生物信号分子,在我们之前还没有确实的证据。2018年,英国的Nicholas Smirnoff专门写过一篇综述(doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.03.033.),通过总结动植物中Vc相关工作,专门提出Vc不太可能是一个信号分子,一个原因是因为关于Vc功能的发现似乎都可以用其氧化还原特性和氧化酶辅因子特性得到完美解释,另一原因是多年来人们一直都没有发现Vc的受体。而我们这篇名为“New insights into Vitamin C function: Vitamin C induces JAK2 activation through its receptor-like transporter SVCT2”(doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.01.120.)的论文以实验数据证明Vc的运输蛋白SVCT2兼具Vc受体的功能,或者准确说是JAK2激酶偶联的Vc受体样运输蛋白。

 

      JAKs是非受体型络氨酸蛋白激酶,通常与缺少络氨酸激酶结构域的细胞表面受体结合而传递细胞外信号。经典的JAK结合受体在细胞因子与受体结合后,JAK被激活并磷酸化受体,形成STATs的停靠位点,进而激活细胞内JAK-STAT信号传导途径。我们的研究结果表明Vc运输蛋白SVCT2具有经典JAK结合受体的全部特征:1. SVCT2与JAK2结合并介导JAK2/STAT2信号途径的激活;2. SVCT2被Vc激活的JAK2磷酸化;3. SVCT2-Y626的磷酸化促进STAT2的招募和激活;4.SVCT2介导的Vc细胞内运输是激活JAK2的必需信号,而JAK2对SVCT2的磷酸化可以促进其Vc运输活性。此外,我们还探讨了Vc引发的JAK2激活的生物学意义,发现JAK2活性对已知的Vc功能可能起到协同促进的作用,比如,Vc通过JAK2磷酸化诱导丙酮酸脱氢酶激酶PDHK1的激活,进而导致丙酮酸脱氢酶复合体 E1α亚基的磷酸化抑制,既抑制线粒体内氧化代谢途径而降低ROS产生;Vc-SVCT2激活的JAK2还可以磷酸化需要Vc作为辅因子的DNA去甲基化酶TET3并促进其活性;JAK2可以磷酸化组蛋白H3Y41,促进染色质结构开放,增加DNA的可接近性等。


图1.jpg

1.  论文的图片摘要

     在这篇20页长文中,我们以9张大图、31个附图和一个摘要图的数据量呈现了我们的发现。从首创性上来说,我们发现了自Vc发现近90年的时间以来人们都没有找到的Vc受体,也因此带来一个原创性的认识:Vc是一个生物信号分子;从颠覆性上来看,Vc是信号分子的性质让前人应用Vc所做的工作,如果仅仅从用其还原性(包括ROS清除和Fe3+的还原)来解释,可能至少是不完整或者缺失了本质上的一些结果。当然,无论是原创还是颠覆性,不是我们自卖自夸就说了算的,一方面需要我们自己进一步提供强有力的证据,另一方面也需要学界关注、评价、验证和拓展我们的发现。经常有人问我这个发现有什么用(其实我也一直在问自己,毕竟身处大学,总是希望自己做的工作与所处环境显得和谐一些),除了理论上可能引起学界对Vc的重新认识之外,其他的方面我还真怕自己说不完全。下面我用一组数据来说明(夸大)一下我们这个发现的作用,在Pubmed上以在摘要中出现“Vitamin C”作为检索条件,目前有5万多篇文献。从图2可以看到,Vitamin C的发文量在1975年突然有一个跃升,从年均几十篇上升到几百篇,因为在1974年Linus Pauling提出了Vc可以用于治疗癌症(Pauling也是因为感冒而发现了蛋白质二级结构而获得诺贝尔奖)。此后,有关Vc的文章每年都稳步提升,Vc可以治疗的疾病也从细菌感染性疾病败血症拓展到感冒、疱疹、肺炎和脊髓灰质炎等病毒性疾病,而Vc对癌症和神经退行性等疾病的治疗也有大量报道。2009年起发现Vc可以作为DNA去甲基化酶和组蛋白去甲基化酶的辅因子进一步使Vc的发文量有一个小幅度的提升,2020年年发文量已经超过2000篇。这些研究工作绝大多数是基于我们对Vc的常规认识(氧化还原特性和氧化酶辅因子)来阐释Vc在各个领域的功能(实话说,我没有全看)。而我们的发现提示如果从信号分子这个角度来看待Vc的功能,可能会有全新的发现。此外,针对新冠疫情的全球肆虐,“中国(上海)方案”中提出使用高浓度Vc治疗重症新冠病人的方法得到国际医疗届的公认,而我们的结果也可能会对Vc治疗方案带来理论上依据。(可惜,以上都是口嗨,因为我不做任何一种疾病)


图2.jpg

2. Vc相关论文1930-2021年的发文量


      说说我们的研究和投稿过程吧。我们接触Vc起源于裴端卿老师在2009年下半年在线发表的一篇文章(doi: 10.1016/j.stem.2009.12.001),他们发现Vc能够促进iPS的诱导。而我当时正好有一个国家自然科学基金面上项目研究Nanog基因的表达调控,于是让一个刚入学的硕士研究生去做一下Vc是否会促进Nanog的表达,结果发现Vc尤其在维甲酸诱导分化的时候会显著拯救小鼠胚胎干细胞的Nanog表达。按照当时正常的思路,应该是检测Vc诱导Nanog启动子区DNA甲基化的变化即可完美解释Vc的作用,可是不知当时我的脑袋怎么被踢了一下(记不清了),却让学生检测了一下Vc激活了细胞内哪些信号传导途径,结果发现JAK2-STAT2途径被激活,于是有了Stem Cells上的这篇文章(doi: 10.1002/stem.1523)。时间到了2011年,博士生郜原(现在甘肃农业大学生命学院)入学,我交给他的课题就是解决Vc为什么会激活JAK2,当时我的思路也很常规,就是让他基于Vc的表观调控作用,从转录组水平找到JAK2激活的线索。但是在仔细分析了Vc诱导的表达谱和microRNA数据后,我们并没有发现能够和JAK-STAT途径相关的任何线索。此时,我的脑袋又被非常关键的踢了一记,由于JAK2通常与膜上的受体结合,我们转向寻找能够结合Vc的膜蛋白,于是Vc的两个运输蛋白SVCT1/2进入了我们的视野。说实话,SVCT1/2是Vc运输蛋白的性质让我对它们能否结合JAK2持有怀疑(当时我的想法与人们对SVCT的认识并无差别),好在我一直坚信生命科学的一句名言:生命现象里唯一没有例外的就是总有例外。2013年,硕士生韩卓入学,与郜原组建在一起。于是,本着“有枣没枣先打三杆子”的态度,我让郜原他们做了SVCTs与JAK2的互作co-IP和细胞内共定位,幸运的是很快有了阳性结果,此时我们的研究思路基本定型。但是,不幸的事情很快发生了,当我要求他们重复实验后,co-IP的结果就陷入了旷日持久的时有时无境地,让我的心也随着结果的阴阳而上下翻腾。好在韩卓针对SVCT2是12次跨膜蛋白的性质将细胞裂解液配方稍作改进后,结果稳定了,实验才进入持续进展阶段。而此时,郜原已经博士毕业,韩卓硕士毕业后念了博士继续完成后续的工作。随着实验的进展,我们也越发坚信自己在做前人未发现的东西,但是这更要求我们把结果要做细做实,不记得多少次我和韩卓在我的小办公室里长谈:关键结果要重复;每一点结论尽量设计不同的实验来验证;寻找并排除可能引起阳性结果的其他因素,避免落入定式思维的逻辑陷阱;图片结果的讨论和质疑等等。

      时间进入20186月,论文的逻辑框架基本搭建成功,所需结果也达到了要求,开始写作。不巧,我母亲生病住院,我在医院的地上睡了近一个月。每天上午我回家吃饭、洗澡、睡觉,中午去是实验室写文章,晚上到医院接班(这是我人生中第一次摊上的大事,所以说人不遇上点事,你就不知道自己有多顽强)。7月末我母亲出院,8月初第一稿完成,首选目标Nature子刊NCB,没过几天拒稿没送审,转投Cell Stem Cell,仍然拒稿。但是编辑Sheila Chari博士似乎对我们的发现有些兴趣,建议我们转投Cell旗下其他子刊,并愿意将他对我们文章的观点告知其他杂志的编辑。于是转投Molecular Cell并马上送审,一个月后不幸再次拒稿,两位审稿人认为虽然结果很有意思,但是还需要大量证据。看了审稿意见,发现我们还是经验不足,在作图时自己嫌图太大,而将必要的一些内参数据拿掉了,这是我们的失误;还有一处数据解读失误,再次安排实验重复后,还是无法解释,好在是不影响主要结果的突变体实验,将这部分删除;针对审稿人有关Vc的错误认识,我们也安排实验以数据进行反驳(其实关于Vc的定式思维使得每个人都觉得自己足够了解Vc,但总是不免存在错误);对转录组数据进行重新分析,对Stem Cells上的前一篇文章的结果进行补充和验证;最关键的是,我们这篇文章最大的不足也被审稿人指出了:由于我们的结果表明Vc的运输和JAK2激活紧密偶联,如何证明JAK2的激活不是由于Vc进入细胞后所引起的其他效应所激活的?虽然我们有一个强有力的证据是SVCT1能够运输更多的Vc进入细胞,但并不能激活JAK2,说明Vc进入细胞内并不能激活JAK2,而JAK2的激活只与SVCT2介导的Vc运输有关。但是只有这一个证据连我也承认略显单薄,尤其是在颠覆人们常规认识的时候的确需要更多证据。针对这个问题,我们又设计了一堆实验:检测了JAK2激活与Vc信号之间的时间关系,发现添加Vc 5分钟就可检测到JAK2激活,30分钟前达到峰值,之后降低然后再升高,这种波动性非常符合信号分子与受体结合后所引发的信号传递特性,同时JAK2的快速激活也排除了Vc通过基因表达调控来激活JAK2的可能(时间不够);Vc进入细胞参加的一个快反应可能是活性氧ROS的清除,于是证明ROS的增加或减少并不影响JAK2的激活;排除Vc的氧化型DHA及其运输蛋白Glut1/3参与激活JAK2的可能;构建SVCT2的Vc运输和JAK2结合突变体,试图将Vc运输与JAK2激活解偶联,但是很不幸这二者高度偶联,影响一方必然会抑制另一方。但是,即使是这些实验,我仍然觉得差点意思,事实上我们至今还在做。

      时间到了20198月,再投Cell Stem Cell被拒,再投Molecular Cell还是被拒,都没有送审,认为还是缺乏证据。转投Nature Communications,仍然被拒,编辑不感兴趣。至此,我出离愤怒了,那就让颠覆来得更猛烈点吧!我们一直有证据表明Jak2可能参与细胞内活性氧ROS水平的调节,但是为了避免引起太过强烈的不适而影响文章发表,我们故意将这部分避而不谈,但是这次,安排!这时,我们已经证明Vc诱导的JAK2对已知的Vc两大功能都有调控作用:ROS清除和需要Vc做辅因子的酶活性磷酸化修饰。2020年7月最后一次尝试Molecular Cell失败,但是此时我们不能再做下去了,破产了呀!转投其他期刊,又是一波连续拒稿,最后一次获得送审并拿到审稿意见是在iScience,三位审稿人其中两位的意见还好说,另一位没有意见只有结论:我不相信Vc是信号分子,然后巴拉巴拉一堆理由。至此,我们开始丧失信心,甚至怀疑这篇文章能否发表了。好在最后Int J Biol Macromol.接收了这篇文章,只是给出了润色文字的修改意见。总之,我们提供了大量的证据表明SVCT2具有Vc受体的功能,这是一个新发现,本不应受到众多杂志的如此苛求。Anyway,还是用智利的Nualart博士安慰我的话做心理治疗吧:“Many times, the journals are really close to new ideas”。

      吹牛了这么多,还是为自己做一个学术广告吧,不然岂不亏了!本人郭泽坤,西北农林科技大学的一名普通教师,书生气臭老九一枚。从2013年起只研究两样东西,一个是小分子Vc作为信号分子对表观修饰的调控,另一个是小蛋白PGC7对早期胚胎中表观修饰的调节作用。像我这样的人应该说是幸运的,这些年来国家自然科学基金面上项目基本没有断档(感谢国家自然科学基金委),使得我们的这个新发现才能坚持到今天面世;但是,像我这样的人也是不幸的,国自然面上项目一项只有60万左右的资助额度,纯基础的研究内容又没能力拿到横向资助,但是做别人没发现的东西就意味着更多的试错过程、更多的实验数据,所以没钱还要做不一样的科研,没钱还要做原创,太难了呀,多少年了不敢出去开会不敢出差,自己心里将这些活动的花销都换算成抗体的价格,这事出去一趟够买一只抗体了,那事出去一趟半只抗体,算来算去还是算了,给学生买抗体吧;像我这样的人,50多岁了,心中早已淡然名利(至少是目前的环境已没有上升可能),之所以执着于将结果发表在有影响力的期刊上,无非是想争取项目或学校支持,能够让我在退休之前将现在做的东西发表出去,不要到了迟暮之年还念念不忘留下遗憾。都说锦上添花易(师出有名),雪中送炭难(所有人都饥寒交迫,凭什么给我?),如果还是以期刊档次代表学术水平的话,我们不太可能获得学校的额外支持,只能寄希望于今年面上项目的获批。但是现在我的经费已经进入负资产运行(这句话让试剂公司看到一定会要求我一次一结,不给赊欠了),我们下一篇关于Vc是生物信号分子的另一个证据的paper估计可以坚持到发表(但已无力补充新的实验内容),而关于小蛋白PGC7在表观修饰调控中另一个新发现才进入关键冲刺期,能否面世或者什么 时候面世都要看今年的面上项目了,阿弥陀佛!像我这样的人,无论是学术背景还是研究兴趣都跟生产实际搭不上边,可偏偏又身处农业大学而且是农业大学的兽医学科,我的研究至少目前来看解决不了生产中的实际问题,也难怪学院不待见,自己也想换个槽给学校学院解决点压力,奈何50多岁了,已经没有跳一跳的可能,所以就这样混吧,虽然我的研究没有“面向国家重大战略需求”(其实好像国家也没说这个战略需求到底是啥需求),但至少我在响应国家的另一个需求“原创发现”,以此自慰吧;像我这样的人,生物化学和分子生物学的学术和教学背景,其实不会做科研,遇到新发现总是习惯性的问为什么,而不是怎么用,这个狗屁倒灶的思维模式只能让我和我学生的工作被人骂得一无是处,多少次幻想着停止招生,质粒和细胞往下水道一倒,愉快滴到春天里去撒欢。但是,我学生的数据总是让我能够从中找到新的苗头,并乐此不疲滴查资料找方案争取做成一个新东西,都说好奇心害死猫,我这个该死的好奇心啥时候才能归于平淡,让我解脱这种艰难的科研圈呢?

       总之,写这篇文字的主要目的是向学界介绍我们的新发现:维生素C的受体SVCT2,希望不要让我们的发现埋没在文献堆里无人关注。我无力做下去了,如果看到别人能够接着做下去,也能满足我的好奇心。同时也请大家关注我们下一篇关于Vc的文章,在这篇文章中我们将进一步证明SVCT2是Vc的受体,并针对另一个持续几十年的关于Vc的争议进行解释:为什么只有高浓度的Vc能够抑制癌症;关于小蛋白PGC7的功能,我已经布局了8年,如果经费允许的话今年也将进入收获期,我们仍然有首创性发现,敬请关注。同时,也请国内同行如果有相关领域的大项目申请,能够带我玩一下,让我承担一些工作分我点经费就行。同时也请有关制药企业、生物公司、医院或食品营养相关企业关注我的工作,Vc是信号分子属于纯基础的更新,但有可能在疾病治疗或营养健康方面带来一些新玩法,我们希望与市场需求进行碰撞和融合,促进基础发现走向应用。


文章链接在这里:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813021001501?via%3Dihub

 

   



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