背景介绍

OsRac1是一种小GTPase，和GDP结合处于非活性状态，和GTP结合处于激活状态。前期研究表明，OsRac1可以诱导水稻对多种病原菌侵染产生免疫。说明OsRac1在植物免疫方面发挥重要作用，但是具体的分子机制仍不清楚。

科学问题

OsRac1增加水稻抗病性的分子机制是什么？

解决方法：筛选OsRac1的互作蛋白。

主要结论

1.OsRac1和NLR家族蛋白互作

使用亲和柱层析法（affinity column chromatography）筛选OsRac1的互作分子，鉴定到了5个NLR蛋白。由于NLR蛋白难于在体内表达，因此使用体外翻译的方法表达NLR蛋白后，进行Pull-down验证互作。发现OsRac1可以和NLR1在体内互作。domain mapping发现，OsRac1和NLR1的NB-ARC domain互作。

由于这5个NLR的功能还没有被研究，它们是否是R蛋白还不清楚。因此，作者找了5个功能已知的R蛋白（Pit, Pib, Pi9, Xa1，Pi-ta）进行了互作验证，发现OsRac1和Pit, Pib, Pi9, Xa1的NB-ARC domain互作。由于OsRac1和Pit的亲和性最强，因此以对两个蛋白进行了后续研究。

2.Pit和OsRac1的定位和互作

亚细胞定位发现，Pit主要定位在细胞膜上，少部分定位在细胞质中。OsRac1也定位在细胞膜上。OsRac1和Pit共定位。BiFC发现，OsRac1和Pit在细胞膜上发生互作，并通过Co-IP（烟草瞬时转化）对互作进行了验证。

3.OsRac1参与Pit介导的植物免疫

为了检测OsRac1与Pit生物学功能之间的关系，在携带有Pit基因的水稻中沉默OsRac1的表达，转基因植株的抗病性降低。

4.Pit激活HR和ROS的产生

将Pit MHD motif的D458V突变，瞬时转化烟草导致HR反应和ROS的积累，而P-loop的K203R突变会抑制D458V突变导致的细胞坏死。

问题：Pit激活HR和ROS的产生和OsRac1有什么关系？

5.Pit激活HR和ROS的产生依赖于OsRac1

将Pit(D458V)和DN-OsRac1（活性降低）共表达，会降低Pit激活HR和诱导ROS的产生，说明Pit激活HR和ROS的产生依赖于OsRac1。

问题：分子机制是什么？

线索：

1.Pit和OsRac1互作，激活状态的Pit和OsRac1的亲和性有什么区别？

2.OsRac1和ATP结合时为活性状态，Pit对OsRac1的激活有什么影响？

6.激活状态的Pit和OsRac1亲和性增强

刚开始试图在烟草叶片中瞬时共表达Pit和OsRac1，以检测它们的亲和性，但是这两个蛋白共表达会导致HR反应，影响蛋白的产生。因此，作者在人成纤维细胞中进行外源共表达，再通过Co-IP检测蛋白亲和性，发现Pit D458V和OsRac1的亲和性增强，而Pit K203RD458V和OsRac1的亲和性降低。说明激活状态的Pit和OsRac1亲和性增强，并且Pit结合ATP的活性是和OsRac1互作必需的。

7.Pit可以激活OsRac1

使用intramolecular FRET system (Raichu)证明，Pit可以激活OsRac1。

技术方法

Take Home Message

1.R蛋白难表达，可在体外翻译，纯化出蛋白后再进行生化试验。

2.本文中R蛋白自激活突变体在植物中表达会发生HR反应，为了解决这种影响，作者在人类成纤维细胞中表达，再进行后续的亲和实验，这是一种可以借鉴的方法。但是，植物蛋白在动物中表达，不知道结果可信度有多高。